Técnicas de ingeniería genética - Genetic engineering techniques
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| Ingeniería genética |
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| Organismos genéticamente modificados |
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La ingeniería genética se puede lograr utilizando múltiples técnicas. Hay una serie de pasos que se siguen antes de que se cree un organismo modificado genéticamente (OMG). Los ingenieros genéticos primero deben elegir qué gen desean insertar, modificar o eliminar. Luego, el gen debe aislarse e incorporarse, junto con otros elementos genéticos, en un vector adecuado . Este vector luego se usa para insertar el gen en el genoma del hospedador, creando un organismo transgénico o editado. La capacidad de diseñar organismos genéticamente se basa en años de investigación y descubrimiento sobre cómo funcionan los genes y cómo podemos manipularlos. Los avances importantes incluyeron el descubrimiento de enzimas de restricción y ADN ligasas y el desarrollo de la secuenciación y la reacción en cadena de la polimerasa .
Esto permitió aislar el gen de interés y luego incorporarlo a un vector. A menudo se añadió una región promotora y terminadora , así como un gen marcador seleccionable . El gen puede modificarse aún más en este punto para que se exprese de manera más eficiente. Luego, este vector se inserta en el genoma del organismo huésped . Para los animales, el gen se inserta típicamente en células madre embrionarias , mientras que en las plantas se puede insertar en cualquier tejido que pueda cultivarse en una planta completamente desarrollada. Las técnicas comunes incluyen microinyección , mediada por virus , Agrobacterium mediada o biolística . Se llevan a cabo más pruebas en el organismo resultante para garantizar una integración, herencia y expresión estables . Los descendientes de la primera generación son heterocigotos , lo que requiere que sean consanguíneos para crear el patrón homocigótico necesario para una herencia estable. La homocigosidad debe confirmarse en muestras de segunda generación.
Las técnicas tradicionales insertaron los genes al azar en el genoma del huésped. Los avances han permitido que los genes se inserten en ubicaciones específicas dentro de un genoma, lo que reduce los efectos secundarios no deseados de la inserción aleatoria. Los primeros sistemas de focalización se basaban en meganucleasas y nucleasas con dedos de zinc . Desde 2009 se han desarrollado sistemas más precisos y fáciles de implementar. Las nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN) y el sistema de ARN guía Cas9 (adaptado de CRISPR ) son los dos más utilizados. Pueden ser potencialmente útiles en la terapia génica y otros procedimientos que requieren una focalización precisa o de alto rendimiento.
Historia
Muchos descubrimientos y avances diferentes llevaron al desarrollo de la ingeniería genética . La manipulación genética dirigida por humanos comenzó con la domesticación de plantas y animales a través de la selección artificial alrededor del año 12.000 a. C. Se desarrollaron varias técnicas para ayudar en la cría y la selección. La hibridación era una forma de introducir cambios rápidos en la composición genética de un organismo. La hibridación de cultivos probablemente ocurrió por primera vez cuando los humanos comenzaron a cultivar individuos genéticamente distintos de especies relacionadas en estrecha proximidad. Algunas plantas pudieron propagarse mediante clonación vegetativa .
La herencia genética fue descubierta por primera vez por Gregor Mendel en 1865, luego de experimentos con guisantes. En 1928, Frederick Griffith demostró la existencia de un "principio transformador" involucrado en la herencia, que fue identificado como ADN en 1944 por Oswald Avery, Colin MacLeod y Maclyn McCarty . Frederick Sanger desarrolló un método para secuenciar el ADN en 1977, aumentando enormemente la información genética disponible para los investigadores.
Tras descubrir la existencia y las propiedades del ADN , hubo que desarrollar herramientas que permitieran manipularlo. En 1970, el laboratorio de Hamilton Smith descubrió las enzimas de restricción , que permitían a los científicos aislar genes del genoma de un organismo. Las ADN ligasas , que unen el ADN roto, se descubrieron a principios de 1967. Al combinar las dos enzimas, fue posible "cortar y pegar" secuencias de ADN para crear ADN recombinante . Los plásmidos , descubiertos en 1952, se convirtieron en herramientas importantes para transferir información entre células y replicar secuencias de ADN. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), desarrollada por Kary Mullis en 1983, permitió amplificar (replicar) pequeñas secciones de ADN y ayudar a la identificación y aislamiento del material genético.
Además de manipular el ADN, hubo que desarrollar técnicas para su inserción en el genoma de un organismo. El experimento de Griffith ya había demostrado que algunas bacterias tenían la capacidad de captar y expresar ADN extraño de forma natural . La competencia artificial se indujo en Escherichia coli en 1970 tratándolas con una solución de cloruro de calcio (CaCl 2 ). La transformación mediante electroporación se desarrolló a fines de la década de 1980, aumentando la eficiencia y el rango bacteriano. En 1907 se descubrió una bacteria que causaba tumores en las plantas, Agrobacterium tumefaciens . A principios de la década de 1970 se descubrió que esta bacteria insertaba su ADN en plantas utilizando un plásmido Ti . Al eliminar los genes del plásmido que causó el tumor y agregar genes nuevos, los investigadores pudieron infectar plantas con A. tumefaciens y dejar que las bacterias insertaran su ADN elegido en los genomas de las plantas.
Elección de genes diana
El primer paso es identificar el gen o genes diana para insertar en el organismo huésped. Esto es impulsado por el objetivo del organismo resultante. En algunos casos, solo se ven afectados uno o dos genes. Para objetivos más complejos, pueden estar involucradas rutas biosintéticas completas que involucran múltiples genes. Una vez encontrados, los genes y otra información genética de una amplia gama de organismos pueden insertarse en bacterias para su almacenamiento y modificación, creando bacterias genéticamente modificadas en el proceso. Las bacterias son baratas, fáciles de cultivar, clonales , se multiplican rápidamente, relativamente fáciles de transformar y pueden almacenarse a -80 ° C casi indefinidamente. Una vez que se aísla un gen, se puede almacenar dentro de la bacteria proporcionando un suministro ilimitado para la investigación.
Se pueden realizar cribados genéticos para determinar genes potenciales seguidos de otras pruebas que identifiquen a los mejores candidatos. Una pantalla simple implica la mutación aleatoria de ADN con sustancias químicas o radiación y luego seleccionar aquellas que muestran el rasgo deseado. Para los organismos donde la mutación no es práctica, los científicos buscan individuos entre la población que presenten la característica a través de mutaciones que ocurren naturalmente. Los procesos que observan un fenotipo y luego intentan identificar el gen responsable se denominan genética directa . Luego, es necesario mapear el gen comparando la herencia del fenotipo con marcadores genéticos conocidos . Es probable que los genes que están juntos se hereden juntos.
Otra opción es la genética inversa . Este enfoque implica apuntar a un gen específico con una mutación y luego observar qué fenotipo se desarrolla. La mutación puede diseñarse para inactivar el gen o solo permitir que se active en determinadas condiciones. Las mutaciones condicionales son útiles para identificar genes que normalmente son letales si no son funcionales. Como genes con funciones similares comparten secuencias similares ( homólogas ), es posible predecir la función probable de un gen comparando su secuencia con la de genes bien estudiados de organismos modelo . El desarrollo de microarrays , transcriptomas y secuenciación del genoma ha facilitado mucho la búsqueda de genes deseables.
La bacteria Bacillus thuringiensis se descubrió por primera vez en 1901 como el agente causante de la muerte de los gusanos de seda . Debido a estas propiedades insecticidas, la bacteria se utilizó como insecticida biológico , desarrollado comercialmente en 1938. Se descubrió que las proteínas cry proporcionaban la actividad insecticida en 1956, y en la década de 1980, los científicos habían clonado con éxito el gen que codifica esta proteína y expresado en las plantas. El gen que proporciona resistencia al herbicida glifosato se encontró después de siete años de buscar bacterias que viven en la tubería de salida de una planta de fabricación de Monsanto RoundUp . En los animales, la mayoría de los genes utilizados son genes de la hormona del crecimiento .
Manipulación de genes
Todos los procesos de ingeniería genética implican la modificación del ADN. Tradicionalmente, el ADN se aisló de las células de los organismos. Más tarde, los genes se clonaron a partir de un segmento de ADN después de la creación de una biblioteca de ADN o se sintetizaron artificialmente . Una vez aislado, se agregan elementos genéticos adicionales al gen para permitir que se exprese en el organismo huésped y ayudar a la selección.
Extracción de células
Primero, la célula debe abrirse suavemente , exponiendo el ADN sin causarle demasiado daño. Los métodos utilizados varían según el tipo de celda. Una vez que está abierto, el ADN debe separarse de los otros componentes celulares. Una célula rota contiene proteínas y otros restos celulares. Mezclando con fenol y / o cloroformo , seguido de centrifugación , los ácidos nucleicos pueden separarse de estos residuos en una fase acuosa superior . Esta fase acuosa puede eliminarse y purificarse adicionalmente si es necesario repitiendo las etapas de fenol-cloroformo. A continuación, los ácidos nucleicos se pueden precipitar de la solución acuosa usando etanol o isopropanol . Cualquier ARN se puede eliminar agregando una ribonucleasa que lo degradará. Muchas empresas ahora venden kits que simplifican el proceso.
Aislamiento de genes
El gen de interés debe separarse del ADN extraído. Si no se conoce la secuencia, un método común es romper el ADN con un método de digestión aleatorio. Esto generalmente se logra usando enzimas de restricción (enzimas que cortan el ADN). Una digestión de restricción parcial corta solo algunos de los sitios de restricción, lo que da como resultado segmentos de fragmentos de ADN superpuestos. Los fragmentos de ADN se colocan en vectores plásmidos individuales y se cultivan dentro de las bacterias. Una vez en la bacteria, el plásmido se copia a medida que la bacteria se divide . Para determinar si un gen útil está presente en un fragmento particular, la biblioteca de ADN se rastrea para el fenotipo deseado . Si se detecta el fenotipo, es posible que la bacteria contenga el gen diana.
Si el gen no tiene un fenotipo detectable o una biblioteca de ADN no contiene el gen correcto, se deben utilizar otros métodos para aislarlo. Si la posición del gen se puede determinar mediante marcadores moleculares , la marcha del cromosoma es una forma de aislar el fragmento de ADN correcto. Si el gen expresa una homología cercana con un gen conocido en otra especie, entonces podría aislarse buscando genes en la biblioteca que coincidan estrechamente con el gen conocido.
Para las secuencias de ADN conocidas, se pueden usar enzimas de restricción que cortan el ADN en cualquier lado del gen. Luego, la electroforesis en gel clasifica los fragmentos según su longitud. Algunos geles pueden separar secuencias que difieren en un solo par de bases . El ADN se puede visualizar tiñéndolo con bromuro de etidio y fotografiando bajo luz ultravioleta . Se puede colocar un marcador con fragmentos de longitudes conocidas junto al ADN para estimar el tamaño de cada banda. La banda de ADN del tamaño correcto debe contener el gen, donde se puede escindir del gel. Otra técnica para aislar genes de secuencias conocidas implica la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR es una herramienta poderosa que puede amplificar una secuencia determinada, que luego puede aislarse mediante electroforesis en gel. Su efectividad disminuye con genes más grandes y tiene el potencial de introducir errores en la secuencia.
Es posible sintetizar genes de forma artificial . Algunas secuencias sintéticas están disponibles comercialmente, renunciando a muchos de estos primeros pasos.
Modificación
El gen que se va a insertar debe combinarse con otros elementos genéticos para que funcione correctamente. El gen se puede modificar en esta etapa para una mejor expresión o efectividad. Además del gen que se va a insertar, la mayoría de las construcciones contienen una región promotora y terminadora , así como un gen marcador seleccionable . La región promotora inicia la transcripción del gen y puede usarse para controlar la ubicación y el nivel de expresión génica, mientras que la región terminadora finaliza la transcripción. Se utiliza un marcador seleccionable, que en la mayoría de los casos confiere resistencia a los antibióticos al organismo en el que se expresa, para determinar qué células se transforman con el nuevo gen. Las construcciones se elaboran utilizando técnicas de ADN recombinante , como digestiones de restricción , ligaciones y clonación molecular .
Inserción de ADN en el genoma del huésped
Una vez que se construye el gen, debe integrarse de manera estable en el genoma del organismo objetivo o existir como ADN extracromosómico . Hay una serie de técnicas disponibles para insertar el gen en el genoma del huésped y varían según el tipo de organismo objetivo. En eucariotas multicelulares , si el transgén se incorpora a las células de la línea germinal del huésped , la célula huésped resultante puede pasar el transgén a su progenie . Si el transgén se incorpora a las células somáticas , el transgén no se puede heredar.
Transformación
La transformación es la alteración directa de los componentes genéticos de una célula al pasar el material genético a través de la membrana celular . Aproximadamente el 1% de las bacterias son naturalmente capaces de absorber ADN extraño , pero esta capacidad puede inducirse en otras bacterias. El estrés de las bacterias con un choque térmico o electroporación puede hacer que la membrana celular sea permeable al ADN que luego puede incorporarse al genoma o existir como ADN extracromosómico. Normalmente, las células se incuban en una solución que contiene cationes divalentes (a menudo cloruro de calcio ) en condiciones frías, antes de exponerse a un pulso de calor (choque térmico). El cloruro de calcio altera parcialmente la membrana celular, lo que permite que el ADN recombinante ingrese a la célula huésped. Se sugiere que exponer las células a cationes divalentes en condiciones frías puede cambiar o debilitar la estructura de la superficie celular, haciéndola más permeable al ADN. Se cree que el pulso de calor crea un desequilibrio térmico a través de la membrana celular, lo que obliga al ADN a ingresar a las células a través de los poros celulares o de la pared celular dañada. La electroporación es otro método para promover la competencia. En este método, las células se electrocutan brevemente con un campo eléctrico de 10-20 kV / cm, que se cree que crea agujeros en la membrana celular a través de los cuales puede entrar el ADN plasmídico. Después de la descarga eléctrica, los orificios se cierran rápidamente mediante los mecanismos de reparación de la membrana de la célula. El ADN captado puede integrarse con el genoma bacteriano o, más comúnmente, existir como ADN extracromosómico .
En las plantas el ADN se inserta a menudo usando Agrobacterium mediada por recombinación , aprovechando la Agrobacterium s T-ADN de secuencia que permite la inserción natural del material genético en las células vegetales. El tejido vegetal se corta en trozos pequeños y se sumerge en un líquido que contiene Agrobacterium suspendido . La bacteria se adherirá a muchas de las células vegetales expuestas por los cortes. La bacteria usa la conjugación para transferir un segmento de ADN llamado T-ADN de su plásmido a la planta. El ADN transferido se dirige al núcleo de la célula vegetal y se integra en el ADN genómico de la planta hospedadora. El ADN plasmídico T se integra de forma semi-aleatoria en el genoma de la célula hospedadora.
Al modificar el plásmido para expresar el gen de interés, los investigadores pueden insertar el gen elegido de forma estable en el genoma de las plantas. Las únicas partes esenciales del T-DNA son sus dos pequeñas repeticiones de borde (25 pares de bases), de las cuales al menos una es necesaria para la transformación de la planta. Los genes que se van a introducir en la planta se clonan en un vector de transformación de plantas que contiene la región del ADN-T del plásmido . Un método alternativo es la agroinfiltración .
Otro método utilizado para transformar células vegetales es la biolística , en la que partículas de oro o tungsteno se recubren con ADN y luego se inyectan en células vegetales jóvenes o embriones vegetales. Algo de material genético ingresa a las células y las transforma. Este método se puede utilizar en plantas que no son susceptibles a la infección por Agrobacterium y también permite la transformación de plastidios de plantas . Las células vegetales también se pueden transformar mediante electroporación, que utiliza una descarga eléctrica para hacer que la membrana celular sea permeable al ADN plasmídico. Debido al daño causado a las células y al ADN, la eficiencia de transformación de la biolística y la electroporación es menor que la transformación de agrobacterias.
Transfección
La transformación tiene un significado diferente en relación con los animales, lo que indica la progresión a un estado canceroso, por lo que el proceso utilizado para insertar ADN extraño en células animales generalmente se denomina transfección. Hay muchas formas de introducir ADN directamente en células animales in vitro . A menudo, estas células son células madre que se utilizan para terapia génica . Los métodos basados en productos químicos utilizan compuestos naturales o sintéticos para formar partículas que facilitan la transferencia de genes a las células. Estos vectores sintéticos tienen la capacidad de unirse al ADN y acomodar grandes transferencias genéticas. Uno de los métodos más simples implica el uso de fosfato de calcio para unir el ADN y luego exponerlo a células cultivadas. La solución, junto con el ADN, está encapsulada por las células. Se pueden usar liposomas y polímeros como vectores para administrar ADN en células animales cultivadas. Los liposomas cargados positivamente se unen al ADN, mientras que los polímeros pueden diseñarse para interactuar con el ADN. Forman lipoplexes y polyplexes respectivamente, que luego son absorbidos por las células. Otras técnicas incluyen el uso de electroporación y biolística. En algunos casos, las células transfectadas pueden integrar de forma estable ADN externo en su propio genoma, este proceso se conoce como transfección estable .
Para crear animales transgénicos, el ADN debe insertarse en embriones o huevos viables. Esto generalmente se logra mediante microinyección , donde el ADN se inyecta a través de la envoltura nuclear de la célula directamente en el núcleo . Los huevos fertilizados superovulados se recolectan en la etapa unicelular y se cultivan in vitro . Cuando los pronúcleos de la cabeza del espermatozoide y el óvulo son visibles a través del protoplasma , se inyecta material genético en uno de ellos. A continuación, el ovocito se implanta en el oviducto de un animal pseudopreñado . Otro método es la transferencia de genes mediada por células madre embrionarias. El gen se transfecta en células madre embrionarias y luego se insertan en blastocistos de ratón que luego se implantan en madres adoptivas. La descendencia resultante es quimérica y el apareamiento posterior puede producir ratones completamente transgénicos con el gen de interés.
Transducción
La transducción es el proceso mediante el cual un virus o un vector viral introduce ADN extraño en una célula . Los virus genéticamente modificados se pueden usar como vectores virales para transferir genes diana a otro organismo en terapia génica . Primero, los genes virulentos se eliminan del virus y, en su lugar, se insertan los genes diana. Las secuencias que permiten al virus insertar los genes en el organismo huésped deben dejarse intactas. Los vectores de virus populares se desarrollan a partir de retrovirus o adenovirus . Otros virus utilizados como vectores incluyen lentivirus , virus de la viruela y virus del herpes . El tipo de virus utilizado dependerá de las células objetivo y de si el ADN se modificará de forma permanente o temporal.
Regeneración
Como a menudo solo una sola célula se transforma con material genético, el organismo debe regenerarse a partir de esa única célula. En las plantas, esto se logra mediante el uso de cultivo de tejidos . Cada especie vegetal tiene diferentes requisitos para una regeneración exitosa. Si tiene éxito, la técnica produce una planta adulta que contiene el transgén en cada célula. En los animales, es necesario asegurarse de que el ADN insertado esté presente en las células madre embrionarias . La descendencia puede someterse a pruebas de detección del gen. Todos los descendientes de la primera generación son heterocigotos para el gen insertado y deben ser consanguíneos para producir una muestra homocigótica . Las bacterias consisten en una sola célula y se reproducen clonalmente, por lo que la regeneración no es necesaria. Los marcadores seleccionables se utilizan para diferenciar fácilmente las células transformadas de las no transformadas.
Las células que se han transformado con éxito con el ADN contienen el gen marcador, mientras que las que no se han transformado no. Al hacer crecer las células en presencia de un antibiótico o químico que selecciona o marca las células que expresan ese gen, es posible separar las células modificadas de las no modificadas. Otro método de detección consiste en una sonda de ADN que se adhiere solo al gen insertado. Estos marcadores suelen estar presentes en el organismo transgénico, aunque se han desarrollado varias estrategias que pueden eliminar el marcador seleccionable de la planta transgénica madura.
Confirmación
Descubrir que un organismo recombinante contiene los genes insertados no suele ser suficiente para garantizar que se expresen adecuadamente en los tejidos previstos. Se realizan más pruebas mediante PCR, hibridación Southern y secuenciación de ADN para confirmar que un organismo contiene el nuevo gen. Estas pruebas también pueden confirmar la ubicación cromosómica y el número de copias del gen insertado. Una vez confirmados, los métodos que buscan y miden los productos génicos (ARN y proteína) también se utilizan para evaluar la expresión génica, la transcripción, los patrones de procesamiento del ARN y la expresión y localización de productos proteicos. Estos incluyen hibridación Northern , RT-PCR cuantitativa , Western blot , inmunofluorescencia , ELISA y análisis fenotípico. Cuando es apropiado, se estudia la descendencia del organismo para confirmar que el transgén y el fenotipo asociado se heredan de manera estable.
Orientación por inserción de genes
Los métodos tradicionales de ingeniería genética generalmente insertan el nuevo material genético al azar dentro del genoma del huésped. Esto puede alterar o alterar otros genes dentro del organismo. Se desarrollaron métodos que insertaron el nuevo material genético en sitios específicos dentro del genoma de un organismo. Los primeros métodos que se dirigían a genes en ciertos sitios dentro de un genoma se basaban en la recombinación homóloga . Al crear construcciones de ADN que contienen una plantilla que coincide con la secuencia del genoma objetivo, es posible que los procesos de HR dentro de la célula inserten la construcción en la ubicación deseada. El uso de este método en células madre embrionarias condujo al desarrollo de ratones transgénicos con knock out dirigidos . También ha sido posible introducir genes o alterar los patrones de expresión génica .
Si se elimina un gen vital, puede resultar letal para el organismo. Para estudiar la función de estos genes, se utilizaron recombinasas específicas de sitio (SSR). Los dos tipos más comunes son los sistemas Cre-LoxP y Flp-FRT . Cre recombinasa es una enzima que elimina el ADN mediante recombinación homóloga entre secuencias de unión conocidas como sitios Lox-P. El sistema Flip-FRT funciona de manera similar, con la recombinasa Flip reconociendo las secuencias de FRT. Al cruzar un organismo que contiene los sitios de recombinasa que flanquean el gen de interés con un organismo que expresa la SSR bajo el control de promotores específicos de tejido , es posible anular o activar genes solo en ciertas células. Esto también se ha utilizado para eliminar genes marcadores de animales transgénicos. Las modificaciones adicionales de estos sistemas permitieron a los investigadores inducir la recombinación solo bajo ciertas condiciones, permitiendo que los genes se eliminen o se expresen en los momentos o etapas de desarrollo deseados .
La edición del genoma utiliza nucleasas diseñadas artificialmente que crean rupturas específicas de doble hebra en las ubicaciones deseadas del genoma. Las roturas están sujetas a procesos de reparación del ADN celular que pueden explotarse para la eliminación, corrección o inserción de genes específicos a altas frecuencias. Si está presente un ADN donante que contiene la secuencia apropiada (homologías), entonces se integrará nuevo material genético que contiene el transgén en el sitio objetivo con alta eficiencia mediante recombinación homóloga . Hay cuatro familias de nucleasas modificadas genéticamente : meganucleasas , ZFN , nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN), CRISPR / Cas (repetición palindrómica corta agrupada regularmente interespaciada / proteína asociada a CRISPR (p. Ej., CRISPR / Cas9) . Entre los cuatro tipos, TALEN y CRISPR / Cas son los dos más utilizados. Los avances recientes han analizado la combinación de varios sistemas para aprovechar las mejores características de ambos (por ejemplo, megaTAL, que es una fusión de un dominio de unión al ADN de TALE y una meganucleasa). Las investigaciones recientes también se han centrado en desarrollar estrategias para crear genes knock-out o correcciones sin crear rupturas de doble cadena (editores de base).
Meganucleasas y nucleasas de dedos de zinc
Las meganucleasas se utilizaron por primera vez en 1988 en células de mamíferos. Las meganucleasas son endodesoxirribonucleasas que funcionan como enzimas de restricción con sitios de reconocimiento largos, lo que las hace más específicas para su sitio objetivo que otras enzimas de restricción . Esto aumenta su especificidad y reduce su toxicidad, ya que no se dirigirán a tantos sitios dentro de un genoma. Las meganucleasas más estudiadas son la familia LAGLIDADG . Si bien las meganucleasas todavía son bastante susceptibles a la unión fuera del objetivo, lo que las hace menos atractivas que otras herramientas de edición de genes, su tamaño más pequeño las hace atractivas, especialmente para las perspectivas de vectorización viral.
Las nucleasas de dedos de zinc (ZFN), utilizadas por primera vez en 1996, se crean típicamente mediante la fusión de dominios de dedos de zinc y el dominio de nucleasa Fok I. Por lo tanto, las ZFN tienen la capacidad de escindir el ADN en los sitios objetivo. Mediante la ingeniería del dominio del dedo de zinc para apuntar a un sitio específico dentro del genoma, es posible editar la secuencia genómica en la ubicación deseada . Las ZFN tienen una mayor especificidad, pero aún tienen el potencial de unirse a secuencias no específicas. Si bien una cierta cantidad de escisión fuera del objetivo es aceptable para crear organismos modelo transgénicos, es posible que no sean óptimas para todos los tratamientos de terapia génica humana.
TALEN y CRISPR
El acceso al código que gobierna el reconocimiento de ADN por efectores similares a activadores de la transcripción (TALE) en 2009 abrió el camino al desarrollo de una nueva clase de herramientas eficientes de edición de genes basadas en TAL. TALE, proteínas secretadas por el patógeno vegetal Xanthomonas, se unen con gran especificidad a los genes dentro de la planta huésped e inician la transcripción de los genes que ayudan a la infección. La ingeniería de TALE fusionando el núcleo de unión del ADN al dominio catalítico de la nucleasa Fok I permitió la creación de una nueva herramienta de nucleasas de diseño, la nucleasa TALE (TALEN). Tienen una de las mayores especificidades de todas las nucleasas modificadas actualmente. Debido a la presencia de secuencias repetidas, son difíciles de construir mediante un procedimiento estándar de biología molecular y se basan en un método más complicado como la clonación Golden Gate .
En 2011, se desarrolló otra tecnología de gran avance basada en sistemas CRISPR / Cas (repetición palindrómica corta agrupada regularmente interespaciada / proteína asociada a CRISPR) que funcionan como un sistema inmunológico adaptativo en bacterias y arqueas . El sistema CRISPR / Cas permite que las bacterias y arqueas luchen contra los virus invasores escindiendo el ADN viral e insertando fragmentos de ese ADN en su propio genoma. Luego, el organismo transcribe este ADN en ARN y combina este ARN con proteínas Cas9 para hacer roturas de doble hebra en el ADN viral invasor. El ARN sirve como guía de ARN para dirigir la enzima Cas9 al lugar correcto en el ADN del virus. Al emparejar proteínas Cas con una guía diseñada, el ARN CRISPR / Cas9 se puede utilizar para inducir roturas de doble hebra en puntos específicos dentro de las secuencias de ADN. La rotura es reparada por enzimas de reparación del ADN celular, creando una pequeña mutación de tipo inserción / deleción en la mayoría de los casos. La reparación de ADN dirigida es posible proporcionando una plantilla de ADN de donante que representa el cambio deseado y que se usa (a veces) para la reparación de roturas de doble cadena mediante recombinación homóloga. Más tarde se demostró que CRISPR / Cas9 puede editar células humanas en un plato. Aunque la primera generación carece de la especificidad de TALEN, la principal ventaja de esta tecnología es la simplicidad del diseño. También permite apuntar a múltiples sitios simultáneamente, lo que permite la edición de múltiples genes a la vez. CRISPR / Cpf1 es un sistema descubierto más recientemente que requiere un ARN guía diferente para crear roturas de doble hebra particulares (deja salientes al escindir el ADN) en comparación con CRISPR / Cas9.
CRISPR / Cas9 es eficiente en la alteración de genes. La creación de bebés resistentes al VIH por el investigador chino He Jiankui es quizás el ejemplo más famoso de alteración genética con este método. Es mucho menos eficaz en la corrección genética. Se están desarrollando métodos de edición de bases en los que se utiliza una endonucleasa Cas 9 “muerta por nucleasa” o una enzima relacionada para el direccionamiento de genes, mientras que una enzima desaminasa enlazada realiza un cambio de base dirigido en el ADN. El perfeccionamiento más reciente de CRISPR-Cas9 se llama Edición Prime. Este método vincula una transcriptasa inversa a una nucleasa de ingeniería guiada por ARN que solo realiza cortes de una sola hebra pero no roturas de doble hebra. Reemplaza la porción de ADN próxima al corte por la acción sucesiva de nucleasa y transcriptasa inversa, introduciendo el cambio deseado de una plantilla de ARN.
Ver también
- Lista de software de ingeniería genética : software para codificar las modificaciones genéticas
- Mutagénesis (técnica de biología molecular)