Extracción de ADN - DNA extraction

Para conocer los diversos métodos, consulte Métodos de ácido nucleico .

El primer aislamiento de ácido desoxirribonucleico (ADN) fue realizado en 1869 por Friedrich Miescher . Actualmente es un procedimiento de rutina en biología molecular o análisis forenses . Para el método químico, se utilizan muchos kits diferentes para la extracción, y seleccionar el correcto ahorrará tiempo en la optimización del kit y los procedimientos de extracción. Se considera que la detección de sensibilidad por PCR muestra la variación entre los kits comerciales.

Procedimiento básico

  • Es necesario recolectar las células que se van a estudiar.
  • Romper las membranas celulares para exponer el ADN junto con el citoplasma interno ( lisis celular ).
  • La solución se trata con una solución salina concentrada (solución salina) para hacer que los desechos como las proteínas rotas, los lípidos y el ARN se agrupen.
  • Centrifugación de la solución, que separa los restos celulares agrupados del ADN.
  • Purificación de ADN a partir de detergentes, proteínas, sales y reactivos utilizados durante la etapa de lisis celular. Los procedimientos más utilizados son:

Las proteínas celulares e histonas unidas al ADN pueden eliminarse añadiendo una proteasa o habiendo precipitado las proteínas con acetato de sodio o amonio , o extrayéndolas con una mezcla de fenol-cloroformo antes de la precipitación del ADN.

Después del aislamiento, el ADN se disuelve en un tampón ligeramente alcalino, normalmente en un tampón TE o en agua ultrapura .

Selección de método

Algunos de los métodos de extracción de ADN más comunes incluyen extracción orgánica , extracción Chelex y extracción en fase sólida . Estos métodos producen sistemáticamente ADN aislado, pero difieren tanto en la calidad como en la cantidad de ADN producido. Al seleccionar un método de extracción de ADN, hay que considerar varios factores, incluidos el costo, el tiempo, la seguridad y el riesgo de contaminación.

La extracción orgánica implica la adición e incubación en múltiples soluciones químicas diferentes; incluyendo una etapa de lisis , una extracción con fenol cloroformo, una precipitación con etanol y etapas de lavado. La extracción orgánica se usa a menudo en los laboratorios porque es barata y produce grandes cantidades de ADN puro. Aunque es fácil, hay muchos pasos involucrados y lleva más tiempo que otros métodos. También implica el uso desfavorable de los productos químicos tóxicos fenol y cloroformo , y existe un mayor riesgo de contaminación debido a la transferencia de ADN entre múltiples tubos. Varios protocolos basados ​​en la extracción orgánica de ADN se desarrollaron efectivamente hace décadas, aunque también se han desarrollado y publicado versiones mejoradas y más prácticas de estos protocolos en los últimos años.

El método de extracción Chelex implica agregar la resina Chelex a la muestra, hervir la solución, luego agitarla y centrifugarla. Los materiales celulares se unen a las perlas de Chelex, mientras que el ADN está disponible en el sobrenadante . El método Chelex es mucho más rápido y simple que la extracción orgánica y solo requiere un tubo, lo que disminuye el riesgo de contaminación del ADN. Desafortunadamente, la extracción de Chelex no produce tanta cantidad y el ADN producido es monocatenario, lo que significa que solo se puede utilizar para análisis basados ​​en PCR y no para RFLP .

La extracción en fase sólida , como el uso de un método de extracción basado en columna de rotación, aprovecha el hecho de que el ADN se une a la sílice . La muestra que contiene ADN se agrega a una columna que contiene gel de sílice o perlas de sílice y sales caotrópicas . Las sales caotrópicas rompen los enlaces de hidrógeno entre las hebras y facilitan la unión del ADN a la sílice al hacer que los ácidos nucleicos se vuelvan hidrófobos. Esto expone los residuos de fosfato para que estén disponibles para la adsorción. El ADN se une a la sílice, mientras que el resto de la solución se lava con etanol para eliminar las sales caotrópicas y otros componentes innecesarios. A continuación, el ADN se puede rehidratar con soluciones acuosas bajas en sal, lo que permite la elución del ADN de las perlas.

Este método produce ADN de alta calidad, en gran parte bicatenario, que se puede utilizar tanto para análisis de PCR como de RFLP . Este procedimiento se puede automatizar y tiene un alto rendimiento, aunque menor que el método de fenol-cloroformo . Este es un método de un solo paso, es decir, todo el procedimiento se completa en un solo tubo. Esto reduce el riesgo de contaminación, lo que lo hace muy útil para la extracción forense de ADN. Los kits comerciales de extracción en fase sólida múltiple son fabricados y comercializados por diferentes empresas; el único problema es que son más caras que la extracción orgánica o la extracción Chelex.

Tipos especiales

Deben elegirse técnicas específicas para el aislamiento del ADN de algunas muestras. Las muestras típicas con aislamiento de ADN complicado son:

  • muestras arqueológicas que contienen ADN parcialmente degradado, ver ADN antiguo
  • muestras que contienen inhibidores de los procedimientos de análisis posteriores, sobre todo inhibidores de la PCR , como el ácido húmico del suelo, el índigo y otros tintes para tejidos o la hemoglobina en la sangre
  • muestras de microorganismos con pared celular gruesa, por ejemplo levadura
  • muestras que contienen ADN mixto de múltiples fuentes

El ADN extracromosómico generalmente es fácil de aislar, especialmente los plásmidos pueden aislarse fácilmente mediante lisis celular seguida de precipitación de proteínas, que atrapa el ADN cromosómico en una fracción insoluble y, después de la centrifugación, el ADN plasmídico se puede purificar a partir de la fracción soluble.

Una extracción de ADN de Hirt es un aislamiento de todo el ADN extracromosómico en una célula de mamífero. El proceso de extracción de Hirt elimina el ADN nuclear de alto peso molecular , dejando solo el ADN mitocondrial de bajo peso molecular y los episomas virales presentes en la célula.

Detección de ADN

Artículo principal: Cuantificación de ácidos nucleicos

Un indicador de difenilamina (DPA) confirmará la presencia de ADN. Este procedimiento implica la hidrólisis química del ADN: cuando se calienta (por ejemplo, ≥95 ° C) en ácido, la reacción requiere un azúcar desoxirribosa y, por lo tanto, es específica para el ADN. En estas condiciones, la 2-desoxirribosa se convierte en w-hidroxilevulinil aldehído, que reacciona con el compuesto, difenilamina, para producir un compuesto de color azul. La concentración de ADN se puede determinar midiendo la intensidad de absorbancia de la solución a 600 nm con un espectrofotómetro y comparándola con una curva estándar de concentraciones de ADN conocidas.

La medición de la intensidad de absorbancia de la solución de ADN a longitudes de onda de 260 nm y 280 nm se utiliza como medida de la pureza del ADN. El ADN se puede cuantificar cortando el ADN con una enzima de restricción , ejecutándolo en un gel de agarosa , tiñendo con bromuro de etidio (EtBr) o una tinción diferente y comparando la intensidad del ADN con un marcador de ADN de concentración conocida.

Utilizando la técnica de transferencia Southern , este ADN cuantificado se puede aislar y examinar más a fondo mediante análisis de PCR y RFLP . Estos procedimientos permiten la diferenciación de las secuencias repetidas dentro del genoma. Son estas técnicas las que utilizan los científicos forenses para la comparación, la identificación y el análisis.

Método de extracción de ADN de alto peso molecular

En este método, los núcleos de las plantas se aíslan triturando físicamente los tejidos y reconstituyendo los núcleos intactos en un tampón de aislamiento nuclear (NIB) único. Los ADN plástidos se liberan de los orgánulos y se eliminan con un tampón osmótico mediante lavado y centrifugación. A continuación, los núcleos purificados se lisan y se limpian adicionalmente mediante extracción orgánica, y el ADN genómico se precipita con una alta concentración de CTAB. El ADNg de alta pureza y alto peso molecular se extrae de los núcleos, se disuelve en un tampón de pH alto, lo que permite un almacenamiento estable a largo plazo.

Ver también

Referencias

Otras lecturas

  • Sambrook, Michael R. Green, Joseph. Clonación molecular . (4ª ed. Ed.). Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Pr. ISBN  1936113422 .
  • Biología forense, Richard Li, (2015) Boca Raton: CRC Press, Taylor & Francis Group. ISBN  9781439889701

enlaces externos