Sonda de hibridación - Hybridization probe

En biología molecular , una sonda de hibridación es un fragmento de ADN o ARN de longitud variable (generalmente de 100 a 10000 bases de longitud) que puede marcarse de forma radiactiva o fluorescente. Luego se puede usar en muestras de ADN o ARN para detectar la presencia de sustancias nucleotídicas (el ARN diana) que son complementarias a la secuencia en la sonda. De este modo, la sonda se hibrida con un ácido nucleico monocatenario (ADN o ARN) cuya secuencia de bases permite el apareamiento de bases sonda-diana debido a la complementariedad entre la sonda y la diana. La sonda marcada se desnaturaliza primero (por calentamiento o en condiciones alcalinas , como la exposición a hidróxido de sodio ) en ADN monocatenario (ssDNA) y luego se hibrida con el ssDNA diana ( Southern blotting ) o ARN ( Northern blotting ) inmovilizado en una membrana o en situ . Para detectar la hibridación de la sonda con su secuencia diana, la sonda se marca (o "marca") con un marcador molecular de moléculas radiactivas o (más recientemente) fluorescentes; Los marcadores comúnmente utilizados son 32 P (un isótopo radiactivo de fósforo incorporado en el enlace fosfodiéster en el ADN de la sonda) o digoxigenina , que es un marcador no radiactivo basado en anticuerpos . Las secuencias de ADN o las transcripciones de ARN que tienen una similitud de secuencia de moderada a alta con la sonda se detectan luego visualizando la sonda hibridada mediante autorradiografía u otras técnicas de formación de imágenes. Normalmente, se toman imágenes de rayos X del filtro o el filtro se coloca bajo luz ultravioleta. La detección de secuencias con similitud moderada o alta depende de cuán estrictas se hayan aplicado las condiciones de hibridación; la alta rigurosidad, como la temperatura de hibridación alta y el bajo contenido de sal en los tampones de hibridación, permite solo la hibridación entre secuencias de ácido nucleico que son muy similares, mientras que la baja rigurosidad, como como temperatura más baja y alta sal, permite la hibridación cuando las secuencias son menos similares. Las sondas de hibridación utilizadas en los microarrays de ADN se refieren a ADN unido covalentemente a una superficie inerte, como portaobjetos de vidrio recubiertos o chips de genes, a los que se hibrida una diana de ADNc móvil.

Dependiendo del método , la sonda se puede sintetizar usando el método de la fosforamidita , o se puede generar y marcar mediante amplificación por PCR o clonación (ambos son métodos más antiguos). Para aumentar la estabilidad in vivo de la sonda, no se usa ARN. En su lugar, pueden usarse análogos de ARN , en particular derivados de morfolino . Las sondas moleculares basadas en ADN o ARN se utilizan de forma rutinaria en el cribado de bibliotecas de genes, la detección de secuencias de nucleótidos con métodos de transferencia y en otras tecnologías de genes, como las micromatrices de ácidos nucleicos y tejidos .

Ejemplos de sondas

Usos en ecología microbiana

Dentro del campo de la ecología microbiana , las sondas de oligonucleótidos se utilizan para determinar la presencia de especies, géneros o microorganismos microbianos clasificados a un nivel más amplio, como bacterias , arqueas y eucariotas mediante hibridación fluorescente in situ (FISH). Las sondas de ARNr han permitido a los científicos visualizar microorganismos, que aún no se han cultivado en el laboratorio, mediante la recuperación de secuencias de ARNr directamente del medio ambiente. Ejemplos de estos tipos de microorganismos incluyen:

  • Nevskia ramosa : N. ramosa es una bacteria de Neuston que forma rosetas típicas de ramificación dicotómica en la superficie de hábitats de agua dulce poco profundos.
  • Achromatium oxaliferum : esta enorme bacteria (longitud celular hasta> 100 µm, diámetro hasta 50 µm) contiene glóbulos de azufre e inclusiones masivas de calcita y habita en las capas superiores de los sedimentos de agua dulce. Es visible a simple vista y, por su resistencia al cultivo, ha desconcertado a generaciones de microbiólogos.

Limitaciones

En algunos casos, la diferenciación entre especies puede ser problemática cuando se utilizan secuencias de ARNr 16S debido a la similitud. En tales casos, el rRNA 23S puede ser una mejor alternativa. La biblioteca estándar mundial de secuencias de ARNr se hace cada vez más grande y se actualiza continuamente, y por lo tanto, la posibilidad de un evento de hibridación aleatorio entre una sonda diseñada específicamente (basada en datos completos y actuales de una variedad de organismos de prueba) y una no deseada / desconocida. El organismo objetivo no puede descartarse fácilmente. Por el contrario, es plausible que existan microorganismos, aún por identificar, que sean miembros filogenéticamente de un grupo objetivo de la sonda, pero que tengan sitios objetivo parciales o casi perfectos. generalmente se aplica al diseñar sondas específicas de grupo.

Probablemente, la mayor limitación práctica de esta técnica es la falta de automatización disponible.

Uso en ciencia forense

En la ciencia forense, las sondas de hibridación se utilizan, por ejemplo, para la detección de regiones de repeticiones cortas en tándem ( microsatélites ) y en los métodos de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción ( RFLP ), todos los cuales se utilizan ampliamente como parte del análisis de perfiles de ADN .

Ver también

Referencias