TaqMan - TaqMan
TaqMan sondas son de hidrólisis sondas que están diseñados para aumentar la especificidad de la PCR cuantitativa . El método fue informado por primera vez en 1991 por el investigador Kary Mullis en Cetus Corporation, y la tecnología fue desarrollada posteriormente por Hoffmann-La Roche para ensayos de diagnóstico y por Applied Biosystems (ahora parte de Thermo Fisher Scientific ) para aplicaciones de investigación.
El principio de la sonda TaqMan se basa en la actividad exonucleasa 5´ – 3´ de la polimerasa Taq para escindir una sonda marcada dual durante la hibridación con la secuencia diana complementaria y la detección basada en fluoróforos . Como en otros métodos de PCR cuantitativa , la señal de fluorescencia resultante permite mediciones cuantitativas de la acumulación del producto durante las etapas exponenciales de la PCR; sin embargo, la sonda TaqMan aumenta significativamente la especificidad de la detección. Las sondas TaqMan recibieron el nombre del videojuego Pac-Man ( Taq Polymerase + PacMan = TaqMan) ya que su mecanismo se basa en el principio Pac-Man.
Principio
Las sondas TaqMan consisten en un fluoróforo unido covalentemente al extremo 5 'de la sonda oligonucleotídica y un extintor en el extremo 3'. Se encuentran disponibles varios fluoróforos diferentes (p. Ej., 6-carboxifluoresceína , acrónimo: FAM , o tetraclorofluoresceína, acrónimo: TET) y extintores (p. Ej., Tetrametil rodamina , acrónimo: TAMRA). La molécula extintor apaga la fluorescencia emitida por el fluoróforo cuando es excitado por la fuente de luz del ciclador a través de la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET). Siempre que el fluoróforo y el inhibidor estén próximos, el inhibidor inhibe cualquier señal de fluorescencia.
Las sondas TaqMan están diseñadas de tal manera que se aparean dentro de una región de ADN amplificada por un conjunto específico de cebadores. (A diferencia del diagrama, la sonda se une al ADN monocatenario). Las sondas TaqMan se pueden conjugar con un resto ligante de surco menor (MGB), tripéptido de dihidrociclopirroloindol (DPI 3 ), para aumentar su afinidad de unión a la secuencia diana; Las sondas conjugadas con MGB tienen una temperatura de fusión más alta (T m ) debido a una mayor estabilización de las fuerzas de van der Waals. A medida que la polimerasa Taq extiende el cebador y sintetiza la hebra naciente (de nuevo, en una plantilla de hebra única, pero en la dirección opuesta a la que se muestra en el diagrama, es decir, de 3 'a 5' de la hebra complementaria), el 5 ' a 3 'la actividad exonucleasa de la polimerasa Taq degrada la sonda que se ha hibridado con el molde. La degradación de la sonda libera el fluoróforo y rompe la proximidad al extintor, aliviando así el efecto de extinción y permitiendo la fluorescencia del fluoróforo. Por tanto, la fluorescencia detectada en el termociclador de PCR cuantitativa es directamente proporcional al fluoróforo liberado y la cantidad de plantilla de ADN presente en la PCR.
Aplicaciones
Los ensayos basados en sondas TaqMan se utilizan ampliamente en PCR cuantitativa en laboratorios médicos y de investigación :
- Ensayos de expresión génica
- Farmacogenómica
- Genotipado del antígeno leucocitario humano (HLA)
- Determinación de carga viral en muestras clínicas ( VIH , Hepatitis )
- Ensayos de identificación bacteriana
- Cuantificación de ADN
- Genotipado de SNP
- Verificación de resultados de microarrays
Ver también
- PCR cuantitativa
- SYBR Verde
- Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa
- Baliza molecular
- La expresion genica
notas y referencias
enlaces externos
1. Recursos de TaqMan RT-PCR : bases de datos de cebadores, software, protocolos
2. Beacon Designer : software para diseñar cebadores y sondas de PCR en tiempo real, incluidos cebadores SYBR Green, sondas TaqMan y balizas moleculares.