Förster transferencia de energía de resonancia - Förster resonance energy transfer

Diagrama de Jablonski de FRET con escalas de tiempo típicas indicadas. Tenga en cuenta que la línea punteada negra indica un fotón virtual .

Förster o transferencia de energía por resonancia de fluorescencia ( FRET ), transferencia de energía por resonancia ( RET ) o transferencia de energía electrónica ( EET ) es un mecanismo que describe la transferencia de energía entre dos moléculas sensibles a la luz ( cromóforos ). Un cromóforo donante, inicialmente en su estado de excitación electrónica, puede transferir energía a un cromóforo aceptor a través del acoplamiento dipolo-dipolo no radiativo . La eficiencia de esta transferencia de energía es inversamente proporcional a la sexta potencia de la distancia entre el donante y el aceptor, lo que hace que FRET sea extremadamente sensible a pequeños cambios en la distancia.

Las mediciones de la eficiencia de FRET se pueden usar para determinar si dos fluoróforos se encuentran a cierta distancia entre sí. Estas mediciones se utilizan como herramienta de investigación en campos como la biología y la química.

FRET es análogo a la comunicación de campo cercano , en el sentido de que el radio de interacción es mucho más pequeño que la longitud de onda de la luz emitida. En la región de campo cercano, el cromóforo excitado emite un fotón virtual que es absorbido instantáneamente por un cromóforo receptor. Estos fotones virtuales son indetectables, ya que su existencia viola la conservación de la energía y el momento y, por lo tanto, FRET se conoce como un mecanismo sin radiación . Se han utilizado cálculos electrodinámicos cuánticos para determinar que la transferencia de energía sin radiación (FRET) y radiativa son las asíntotas de corto y largo alcance de un único mecanismo unificado.

Terminología

Diagrama de dibujos animados del concepto de transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET).

La transferencia de energía de resonancia de Förster lleva el nombre del científico alemán Theodor Förster . Cuando ambos cromóforos son fluorescentes, el término "transferencia de energía de resonancia de fluorescencia" se usa a menudo en su lugar, aunque la energía no se transfiere realmente por fluorescencia . Para evitar una interpretación errónea del fenómeno que es siempre una transferencia de energía no radiativa (incluso cuando ocurre entre dos cromóforos fluorescentes), se prefiere el nombre "transferencia de energía de resonancia de Förster" a "transferencia de energía de resonancia de fluorescencia"; sin embargo, este último goza de un uso común en la literatura científica. FRET no se limita a la fluorescencia y también se produce en relación con la fosforescencia.

Bases teóricas

La eficiencia FRET ( ) es el rendimiento cuántico de la transición de transferencia de energía, es decir, la probabilidad de que ocurra un evento de transferencia de energía por evento de excitación del donante: ${\ Displaystyle E}$

{\ Displaystyle E = {\ frac {k _ {\ text {ET}}} {k_ {f} + k _ {\ text {ET}} + \ sum {k_ {i}}}},}

donde es la tasa de transferencia de energía, la tasa de desintegración radiativa del donante y las tasas de cualquier otra vía de desexcitación excluyendo las transferencias de energía a otros aceptores. ${\ Displaystyle k _ {\ text {ET}}}$ ${\ Displaystyle k_ {f}}$ ${\ Displaystyle k_ {i}}$

La eficiencia de FRET depende de muchos parámetros físicos que se pueden agrupar como: 1) la distancia entre el donante y el aceptor (generalmente en el rango de 1 a 10 nm), 2) la superposición espectral del espectro de emisión del donante y la absorción del aceptor espectro , y 3) la orientación relativa del momento dipolar de emisión del donante y el momento dipolar de absorción del aceptor.

${\ Displaystyle E}$ depende de la distancia de separación donante-aceptor con una ley de sexta potencia inversa debido al mecanismo de acoplamiento dipolo-dipolo: ${\ Displaystyle r}$

{\ displaystyle E = {\ frac {1} {1+ (r / R_ {0}) ^ {6}}}}

con siendo la distancia Förster de este par de donante y aceptor, es decir, la distancia a la que la eficiencia de transferencia de energía es 50%. La distancia de Förster depende de la integral de superposición del espectro de emisión del donante con el espectro de absorción del aceptor y su orientación molecular mutua como se expresa en la siguiente ecuación: ${\ Displaystyle R_ {0}}$

{\ Displaystyle {R_ {0}} ^ {6} = {\ frac {2.07} {128 \, \ pi ^ {5} \, N_ {A}}} \, {\ frac {\ kappa ^ {2} \, Q_ {D}} {n ^ {4}}} {\ int F _ {\ rm {D}} (\ lambda) \, \ epsilon _ {\ rm {A}} (\ lambda) \, \ lambda ^ {4} \, d \ lambda}}

donde es el rendimiento cuántico de fluorescencia del donante en ausencia del aceptor, es el factor de orientación del dipolo, es el índice de refracción del medio, es la constante de Avogadro y es la integral de superposición espectral calculada como ${\ Displaystyle Q _ {\ text {D}}}$ ${\ Displaystyle \ kappa ^ {2}}$ ${\ Displaystyle n}$ ${\ Displaystyle N _ {\ text {A}}}$ ${\ Displaystyle J}$

{\ Displaystyle J = {\ frac {\ int f _ {\ text {D}} (\ lambda) \ epsilon _ {\ text {A}} (\ lambda) \ lambda ^ {4} \, d \ lambda} { \ int f _ {\ text {D}} (\ lambda) \, d \ lambda}} = \ int {\ overline {f _ {\ text {D}}}} (\ lambda) \ epsilon _ {\ text {A }} (\ lambda) \ lambda ^ {4} \, d \ lambda,}

donde es el espectro de emisión del donante, es el espectro de emisión del donante normalizado a un área de 1, y es el coeficiente de extinción molar del aceptor , normalmente obtenido a partir de un espectro de absorción. El factor de orientación $κ$ viene dado por ${\ Displaystyle f _ {\ text {D}}}$ ${\ Displaystyle {\ overline {f _ {\ text {D}}}}}$ ${\ Displaystyle \ epsilon _ {\ text {A}}}$

{\ Displaystyle \ kappa = {\ hat {\ mu}} _ {\ text {A}} \ cdot {\ hat {\ mu}} _ {\ text {D}} - 3 ({\ hat {\ mu} } _ {\ text {D}} \ cdot {\ hat {R}}) ({\ hat {\ mu}} _ {\ text {A}} \ cdot {\ hat {R}}),}

donde denota el momento dipolar de transición normalizado del respectivo fluoróforo, y denota el desplazamiento inter-fluoróforo normalizado. A menudo se asume = 2/3. Este valor se obtiene cuando ambos colorantes giran libremente y se puede considerar que están orientados isotrópicamente durante la vida útil del estado excitado. Si alguno de los tintes es fijo o no puede rotar libremente, entonces = 2/3 no será una suposición válida. En la mayoría de los casos, sin embargo, incluso modesta reorientación de los colorantes resulta en un promedio de orientación suficiente que = 2/3 no da lugar a un gran error en la distancia estimada de transferencia de energía debido a la dependencia de sexta potencia del sobre . Incluso cuando es bastante diferente de 2/3, el error se puede asociar con un desplazamiento y, por lo tanto, las determinaciones de los cambios en la distancia relativa para un sistema en particular siguen siendo válidas. Las proteínas fluorescentes no se reorientan en una escala de tiempo más rápida que su vida útil de fluorescencia. En este caso 0 ≤ ≤ 4. ${\ Displaystyle {\ hat {\ mu}} _ {i}}$ ${\ Displaystyle {\ hat {R}}}$ ${\ Displaystyle \ kappa ^ {2}}$ ${\ Displaystyle \ kappa ^ {2}}$ ${\ Displaystyle \ kappa ^ {2}}$ ${\ Displaystyle R_ {0}}$ ${\ Displaystyle \ kappa ^ {2}}$ ${\ Displaystyle \ kappa ^ {2}}$ ${\ Displaystyle R_ {0}}$ ${\ Displaystyle \ kappa ^ {2}}$

Para análisis de FRET dependientes del tiempo, la tasa de transferencia de energía ( ) se puede usar directamente en su lugar: ${\ Displaystyle k _ {\ text {ET}}}$

{\ Displaystyle k _ {\ text {ET}} = ({\ frac {R_ {0}} {r}}) ^ {6} \, {\ frac {1} {\ tau _ {D}}}}

donde es la vida útil de la fluorescencia del donante en ausencia del aceptor. ${\ Displaystyle \ tau _ {D}}$

La eficiencia de FRET se relaciona con el rendimiento cuántico y la vida útil de la fluorescencia de la molécula donante de la siguiente manera:

{\ Displaystyle E = 1- \ tau '_ {\ text {D}} / \ tau _ {\ text {D}},}

donde y son los tiempos de vida de la fluorescencia del donante en presencia y ausencia de un aceptor respectivamente, o como ${\ Displaystyle \ tau _ {\ text {D}} '}$ ${\ Displaystyle \ tau _ {\ text {D}}}$

{\ Displaystyle E = 1-F _ {\ text {D}} '/ F _ {\ text {D}},}

donde y son las intensidades de fluorescencia del donante con y sin un aceptor, respectivamente. ${\ Displaystyle F _ {\ text {D}} '}$ ${\ Displaystyle F _ {\ text {D}}}$

Confirmación experimental de la teoría de transferencia de energía por resonancia de Förster

La dependencia inversa de la distancia de sexta potencia de la transferencia de energía de resonancia de Förster fue confirmada experimentalmente por Wilchek , Edelhoch y Brand utilizando péptidos triptofilos. Stryer , Haugland e Yguerabide también demostraron experimentalmente la dependencia teórica de la transferencia de energía de resonancia de Förster en la integral de superposición mediante el uso de un indolosteroide fusionado como donante y una cetona como aceptor. Sin embargo, se observaron muchas contradicciones de experimentos especiales con la teoría. La razón es que la teoría tiene un carácter aproximado y da distancias sobreestimadas de 50 a 100 ångströms.

Métodos para medir la eficiencia de FRET

En microscopía de fluorescencia , microscopía de barrido láser confocal de fluorescencia , así como en biología molecular , FRET es una herramienta útil para cuantificar la dinámica molecular en biofísica y bioquímica , como interacciones proteína- proteína, interacciones proteína- ADN y cambios conformacionales de proteína. Para controlar la formación del complejo entre dos moléculas, una de ellas se marca con un donante y la otra con un aceptor. La eficiencia de FRET se mide y se usa para identificar interacciones entre los complejos marcados. Hay varias formas de medir la eficiencia de FRET controlando los cambios en la fluorescencia emitida por el donante o el aceptor.

Emisión sensibilizada

Un método para medir la eficiencia de FRET es medir la variación en la intensidad de emisión del aceptor. Cuando el donante y el aceptor están en la proximidad (1-10 nm) debido a la interacción de las dos moléculas, la emisión del aceptor aumentará debido a la FRET intermolecular del donante al aceptor. Para controlar los cambios conformacionales de la proteína, la proteína diana se marca con un donante y un aceptor en dos loci. Cuando una torsión o doblez de la proteína provoca el cambio en la distancia u orientación relativa del donante y el aceptor, se observa un cambio de FRET. Si una interacción molecular o un cambio conformacional de una proteína depende de la unión del ligando , esta técnica FRET es aplicable a indicadores fluorescentes para la detección del ligando.

Fotoblanqueo FRET

Las eficiencias de FRET también se pueden inferir de las tasas de fotoblanqueo del donante en presencia y ausencia de un aceptor. Este método se puede realizar en la mayoría de los microscopios de fluorescencia; uno simplemente ilumina la luz de excitación (de una frecuencia que excitará al donante pero no al aceptor de manera significativa) en las muestras con y sin el fluoróforo aceptor y monitorea la fluorescencia del donante (típicamente separada de la fluorescencia del aceptor usando un filtro de paso de banda ) a lo largo del tiempo. La escala de tiempo es la del fotoblanqueo, que es de segundos a minutos, con la fluorescencia en cada curva dada por

{\ Displaystyle {\ text {background}} + {\ text {constante}} \ cdot e ^ {- {\ text {time}} / \ tau _ {\ text {pb}}},}

donde es el tiempo de decaimiento del fotoblanqueo constante y depende de si el aceptor está presente o no. Dado que el fotoblanqueo consiste en la inactivación permanente de fluoróforos excitados, la transferencia de energía de resonancia de un donante excitado a un fluoróforo aceptor evita el fotoblanqueo de ese fluoróforo donante y, por lo tanto, una alta eficiencia de FRET conduce a una constante de tiempo de desintegración del fotoblanqueo más prolongada: ${\ Displaystyle \ tau _ {\ text {pb}}}$

{\ Displaystyle E = 1- \ tau _ {\ text {pb}} / \ tau _ {\ text {pb}} ',}

donde y son las constantes de tiempo de degradación del fotoblanqueo del donante en presencia y en ausencia del aceptor, respectivamente. (Observe que la fracción es el recíproco de la utilizada para las mediciones de la vida útil). ${\ Displaystyle \ tau _ {\ text {pb}} '}$ ${\ Displaystyle \ tau _ {\ text {pb}}}$

Esta técnica fue introducida por Jovin en 1989. Su uso de una curva completa de puntos para extraer las constantes de tiempo puede darle ventajas de precisión sobre los otros métodos. Además, el hecho de que las mediciones de tiempo se realicen en segundos en lugar de nanosegundos lo hace más fácil que las mediciones de vida útil de la fluorescencia, y debido a que las tasas de desintegración del fotoblanqueo generalmente no dependen de la concentración del donante (a menos que la saturación del aceptor sea un problema), el control cuidadoso de las concentraciones es necesario para la intensidad. no se necesitan medidas. Sin embargo, es importante mantener la misma iluminación para las mediciones con y sin aceptor, ya que el fotoblanqueo aumenta notablemente con la luz incidente más intensa.

Medidas de por vida

La eficiencia de FRET también se puede determinar a partir del cambio en la vida útil de la fluorescencia del donante. La vida del donante disminuirá en presencia del aceptor. Las mediciones de por vida del donante de FRET se utilizan en microscopía de imágenes de fluorescencia de por vida (FLIM).

Fluoróforos utilizados para FRET

Si el enlazador está intacto, la excitación en la longitud de onda de absorbancia de CFP (414 nm) provoca la emisión de YFP (525 nm) debido a FRET. Si el enlazador es escindido por una proteasa, FRET se suprime y la emisión se encuentra en la longitud de onda de CFP (475 nm).

Pares CFP-YFP

Un par común de fluoróforos para uso biológico es un par de proteína fluorescente cian (CFP) - proteína fluorescente amarilla (YFP). Ambos son variantes de color de la proteína verde fluorescente (GFP). El etiquetado con tintes fluorescentes orgánicos requiere purificación, modificación química e inyección intracelular de una proteína huésped. Las variantes de GFP se pueden unir a una proteína huésped mediante ingeniería genética, lo que puede ser más conveniente. Además, una fusión de CFP y YFP ("dímero en tándem") unida por una secuencia de escisión de proteasa puede usarse como ensayo de escisión.

BRET

Una limitación de FRET realizada con donantes de fluoróforos es el requisito de iluminación externa para iniciar la transferencia de fluorescencia, que puede conducir a ruido de fondo en los resultados de la excitación directa del aceptor o al fotoblanqueo . Para evitar este inconveniente, se ha desarrollado la transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (o BRET ). Esta técnica utiliza una luciferasa bioluminiscente (típicamente la luciferasa de Renilla reniformis ) en lugar de CFP para producir una emisión de fotones inicial compatible con YFP.

BRET también se ha implementado utilizando una enzima luciferasa diferente, creada a partir del camarón de aguas profundas Oplophorus gracilirostris . Esta luciferasa es más pequeña (19 kD) y más brillante que la luciferasa más comúnmente utilizada de Renilla reniformis ., Y se ha denominado NanoLuc o NanoKAZ. Promega ha desarrollado un sustrato patentado para NanoLuc llamado furimazina, aunque también se han publicado otros sustratos de coelenterazina valiosos para NanoLuc Promega ha desarrollado una versión de proteína dividida de NanoLuc, que también se ha utilizado como donante BRET en experimentos que miden las interacciones proteína-proteína

Homo-FRET

En general, "FRET" se refiere a situaciones en las que las proteínas donantes y aceptoras (o "fluoróforos") son de dos tipos diferentes. Sin embargo, en muchas situaciones biológicas, los investigadores pueden necesitar examinar las interacciones entre dos o más proteínas del mismo tipo, o incluso la misma proteína consigo misma, por ejemplo, si la proteína se pliega o forma parte de una cadena polimérica de proteínas o para otras cuestiones de cuantificación en células biológicas.

Obviamente, las diferencias espectrales no serán la herramienta utilizada para detectar y medir FRET, ya que tanto la proteína aceptora como la donante emiten luz con las mismas longitudes de onda. Sin embargo, los investigadores pueden detectar diferencias en la polarización entre la luz que excita los fluoróforos y la luz que se emite, en una técnica llamada imagen de anisotropía FRET; el nivel de anisotropía cuantificada (diferencia de polarización entre los haces de excitación y emisión) se convierte entonces en una guía indicativa de cuántos eventos FRET han ocurrido.

Otros

Varios compuestos además de proteínas fluorescentes.

Aplicaciones

Las aplicaciones de la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) se han expandido enormemente en los últimos 25 años, y la técnica se ha convertido en un elemento básico en muchos campos biológicos y biofísicos . FRET se puede utilizar como una regla espectroscópica para medir la distancia y detectar interacciones moleculares en varios sistemas y tiene aplicaciones en biología y bioquímica.

Proteinas

FRET se usa a menudo para detectar y rastrear interacciones entre proteínas. Además, FRET puede usarse para medir distancias entre dominios en una sola proteína marcando diferentes regiones de la proteína con fluoróforos y midiendo la emisión para determinar la distancia. Esto proporciona información sobre la conformación de proteínas , incluidas las estructuras secundarias y el plegamiento de proteínas . Esto se extiende al seguimiento de los cambios funcionales en la estructura de las proteínas, como los cambios conformacionales asociados con la actividad de la miosina . Aplicado in vivo, FRET se ha utilizado para detectar la ubicación y las interacciones de estructuras celulares, incluidas las integrinas y las proteínas de membrana .

Membranas

FRET se puede utilizar para observar la fluidez de la membrana , el movimiento y la dispersión de las proteínas de la membrana, las interacciones lípido-proteína y proteína-proteína de la membrana, y la mezcla exitosa de diferentes membranas. FRET también se utiliza para estudiar la formación y las propiedades de los dominios de la membrana y las balsas lipídicas en las membranas celulares y para determinar la densidad de superficie en las membranas.

Quimiosensorial

Sonda basada en FRET que se activa al interactuar con Cd2 +

Las sondas basadas en FRET pueden detectar la presencia de varias moléculas: la estructura de la sonda se ve afectada por la unión o actividad de moléculas pequeñas, lo que puede activar o desactivar el sistema FRET. Esto se usa a menudo para detectar aniones, cationes, pequeñas moléculas sin carga y también algunas biomacromoléculas más grandes. De manera similar, los sistemas FRET se han diseñado para detectar cambios en el entorno celular debido a factores como el pH , la hipoxia o el potencial de la membrana mitocondrial .

Vías de señalización

Otro uso de FRET es el estudio de vías metabólicas o de señalización . Por ejemplo, FRET y BRET se han utilizado en varios experimentos para caracterizar la activación del receptor acoplado a proteína G y los consiguientes mecanismos de señalización. Otros ejemplos incluyen el uso de FRET para analizar procesos tan diversos como la quimiotaxis bacteriana y la actividad de caspasa en la apoptosis .

Otras aplicaciones

Además de los usos comunes mencionados anteriormente, FRET y BRET también son efectivos en el estudio de la cinética de reacciones bioquímicas. FRET se usa cada vez más para monitorear el ensamblaje y desensamblaje dependiente del pH y es valioso en el análisis de ácidos nucleicos . Esta técnica se puede utilizar para determinar los factores que afectan a varios tipos de formación de nanopartículas , así como los mecanismos y efectos de las nanomedicinas .

Otros metodos

Un mecanismo diferente, pero relacionado, es la transferencia de electrones de Dexter .

Un método alternativo para detectar la proximidad proteína-proteína es la complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC), donde dos partes de una proteína fluorescente se fusionan cada una con otras proteínas. Cuando estas dos partes se encuentran, forman un fluoróforo en una escala de tiempo de minutos u horas.

Ver también

Referencias

enlaces externos

Efecto FRET en una película fina en YouTube
FRET Imaging (Tutorial de Becker & Hickl, sitio web)

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