Microscopía - Microscopy

Imagen de microscopio electrónico de barrido de polen

Examen microscópico en un laboratorio bioquímico

La microscopía es el campo técnico del uso de microscopios para ver objetos y áreas de objetos que no se pueden ver a simple vista (objetos que no están dentro del rango de resolución del ojo normal). Hay tres ramas bien conocidos de microscopía: óptica , electrónica y microscopía de barrido de sonda , junto con el campo emergente de la microscopía de rayos X .

La microscopía óptica y la microscopía electrónica involucran la difracción , reflexión o refracción de radiación electromagnética / haces de electrones que interactúan con la muestra , y la recolección de radiación dispersa u otra señal para crear una imagen. Este proceso puede llevarse a cabo mediante irradiación de campo amplio de la muestra (por ejemplo, microscopía óptica estándar y microscopía electrónica de transmisión ) o escaneando un haz fino sobre la muestra (por ejemplo, microscopía de escaneo láser confocal y microscopía electrónica de escaneo ). La microscopía de sonda de barrido implica la interacción de una sonda de barrido con la superficie del objeto de interés. El desarrollo de la microscopía revolucionó la biología , dio lugar al campo de la histología y, por tanto, sigue siendo una técnica esencial en las ciencias físicas y de la vida . La microscopía de rayos X es tridimensional y no destructiva, lo que permite obtener imágenes repetidas de la misma muestra para estudios in situ o 4D, y brinda la capacidad de "ver dentro" de la muestra que se está estudiando antes de sacrificarla por técnicas de mayor resolución. Un microscopio de rayos X 3D utiliza la técnica de tomografía computarizada (microCT), rotando la muestra 360 grados y reconstruyendo las imágenes. La TC se realiza normalmente con una pantalla plana. Un microscopio de rayos X 3D emplea una variedad de objetivos, por ejemplo, de 4X a 40X, y también puede incluir un panel plano.

Historia

A menudo considerado como el primer microscopista y microbiólogo reconocido , Antonie van Leeuwenhoek es mejor conocido por su trabajo pionero en el campo de la microscopía y por sus contribuciones al establecimiento de la microbiología como disciplina científica.

El campo de la microscopía (microscopía óptica ) se remonta al menos al siglo XVII. Los primeros microscopios, lupas de una sola lente con aumento limitado, datan al menos desde el uso generalizado de lentes en anteojos en el siglo XIII, pero los microscopios compuestos más avanzados aparecieron por primera vez en Europa alrededor de 1620.Los primeros practicantes de la microscopía incluyen a Galileo Galilei , quien descubrió en 1610 que podía enfocar de cerca su telescopio para ver objetos pequeños de cerca y Cornelis Drebbel , quien pudo haber inventado el microscopio compuesto alrededor de 1620 Antonie van Leeuwenhoek desarrolló un microscopio simple de muy alto aumento en la década de 1670 y a menudo se lo considera el primer microscopista y microbiólogo reconocido .

Microscopia óptica

Microscopio estereoscópico

La microscopía óptica o de luz implica el paso de la luz visible transmitida a través o reflejada de la muestra a través de una sola lente o múltiples lentes para permitir una vista ampliada de la muestra. La imagen resultante puede ser detectada directamente por el ojo, fotografiada en una placa fotográfica o capturada digitalmente . La lente única con sus accesorios, o el sistema de lentes y equipo de imágenes, junto con el equipo de iluminación apropiado, la plataforma de muestreo y el soporte, conforman el microscopio óptico básico. El desarrollo más reciente es el microscopio digital , que utiliza una cámara CCD para enfocar la exhibición de interés. La imagen se muestra en la pantalla de una computadora, por lo que los oculares son innecesarios.

Limitaciones

Las limitaciones de la microscopía óptica estándar (microscopía de campo brillante ) se encuentran en tres áreas;

• Esta técnica solo puede obtener imágenes de objetos oscuros o que refractan fuertemente de manera efectiva.
• Existe una resolución limitada por difracción en función de la longitud de onda incidente; en el rango visible, la resolución de la microscopía óptica se limita a aproximadamente 0,2   micrómetros ( ver: microscopio ) y el límite de aumento práctico a ~ 1500x.
• La luz desenfocada de puntos fuera del plano focal reduce la claridad de la imagen.

Las células vivas en particular generalmente carecen de suficiente contraste para ser estudiadas con éxito, ya que las estructuras internas de la célula son incoloras y transparentes. La forma más común de aumentar el contraste es teñir las diferentes estructuras con tintes selectivos, pero esto a menudo implica matar y fijar la muestra. La tinción también puede introducir artefactos , que son detalles estructurales aparentes que son causados ​​por el procesamiento de la muestra y, por lo tanto, no son características legítimas de la muestra. En general, estas técnicas hacen uso de diferencias en el índice de refracción de las estructuras celulares. La microscopía de campo brillante es comparable a mirar a través de una ventana de vidrio: no se ve el vidrio, sino simplemente la suciedad en el vidrio. Hay una diferencia, ya que el vidrio es un material más denso, y esto crea una diferencia en la fase de paso de la luz. El ojo humano no es sensible a esta diferencia de fase, pero se han ideado soluciones ópticas inteligentes para cambiar esta diferencia de fase en una diferencia de amplitud (intensidad de la luz).

Técnicas

Para mejorar el contraste de la muestra o resaltar ciertas estructuras en una muestra, se deben utilizar técnicas especiales. Se encuentra disponible una gran selección de técnicas de microscopía para aumentar el contraste o etiquetar una muestra.

• Cuatro ejemplos de técnicas de transiluminación utilizadas para generar contraste en una muestra de papel tisú . 1,559 μm / píxel.
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  Iluminación de campo brillante , el contraste de la muestra proviene de la absorbancia de luz en la muestra.

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  Iluminación de luz polarizada cruzada , el contraste de la muestra proviene de la rotación de la luz polarizada a través de la muestra.

• 

  Iluminación de campo oscuro , el contraste de la muestra proviene de la luz dispersada por la muestra.

• 

  Iluminación de contraste de fase , el contraste de la muestra proviene de la interferencia de diferentes longitudes de trayectoria de luz a través de la muestra.

Campo Claro

La microscopía de campo brillante es la más simple de todas las técnicas de microscopía óptica. La iluminación de la muestra se realiza mediante luz blanca transmitida, es decir, iluminada desde abajo y observada desde arriba. Las limitaciones incluyen el bajo contraste de la mayoría de las muestras biológicas y la baja resolución aparente debido al desenfoque del material desenfocado. La simplicidad de la técnica y la mínima preparación de la muestra requerida son ventajas significativas.

Iluminación oblicua

El uso de iluminación oblicua (lateral) le da a la imagen una apariencia tridimensional (3D) y puede resaltar características que de otro modo serían invisibles. Una técnica más reciente basada en este método es el contraste de modulación de Hoffmann , un sistema que se encuentra en microscopios invertidos para su uso en cultivo celular. La iluminación oblicua adolece de las mismas limitaciones que la microscopía de campo brillante (bajo contraste de muchas muestras biológicas; baja resolución aparente debido a objetos desenfocados).

Campo oscuro

La microscopía de campo oscuro es una técnica para mejorar el contraste de muestras transparentes sin teñir. La iluminación de campo oscuro utiliza una fuente de luz cuidadosamente alineada para minimizar la cantidad de luz transmitida directamente (no dispersada) que ingresa al plano de la imagen, recolectando solo la luz dispersada por la muestra. El campo oscuro puede mejorar drásticamente el contraste de la imagen, especialmente de los objetos transparentes, al tiempo que requiere poca configuración de equipo o preparación de muestras. Sin embargo, la técnica adolece de una baja intensidad de luz en la imagen final de muchas muestras biológicas y sigue viéndose afectada por una baja resolución aparente.

Una diatomea bajo la iluminación de Rheinberg

La iluminación de Rheinberg es una variante especial de la iluminación de campo oscuro en la que se insertan filtros de colores transparentes justo antes del condensador para que los rayos de luz en la apertura alta sean de colores diferentes a los de la apertura baja (es decir, el fondo de la muestra puede ser azul mientras que el el objeto aparece en rojo autoluminoso). Son posibles otras combinaciones de colores, pero su eficacia es bastante variable.

Tinción por dispersión

La tinción por dispersión es una técnica óptica que da como resultado una imagen coloreada de un objeto incoloro. Esta es una técnica de tinción óptica y no requiere tintes ni tintes para producir un efecto de color. Hay cinco configuraciones de microscopio diferentes que se utilizan en la técnica más amplia de tinción por dispersión. Incluyen línea de Becke de campo claro, oblicua, campo oscuro, contraste de fase y tinción de dispersión de parada objetiva.

Contraste de fase

Micrografía de luz de contraste de fase de cartílago hialino no calcificado que muestra condrocitos y orgánulos , lagunas y matriz extracelular .

En microscopía electrónica : imágenes de contraste de fase

Las técnicas más sofisticadas mostrarán diferencias proporcionales en la densidad óptica. El contraste de fase es una técnica ampliamente utilizada que muestra las diferencias en el índice de refracción como diferencia en el contraste. Fue desarrollado por el físico holandés Frits Zernike en la década de 1930 (por lo que fue galardonado con el Premio Nobel en 1953). El núcleo de una célula, por ejemplo, se mostrará de forma oscura contra el citoplasma circundante. El contraste es excelente; sin embargo, no debe usarse con objetos gruesos. Con frecuencia, se forma un halo incluso alrededor de objetos pequeños, lo que oscurece los detalles. El sistema consta de un anillo circular en el condensador, que produce un cono de luz. Este cono se superpone a un anillo de tamaño similar dentro del objetivo de fase. Cada objetivo tiene un anillo de diferente tamaño, por lo que para cada objetivo se debe elegir otro ajuste de condensador. El anillo del objetivo tiene propiedades ópticas especiales: en primer lugar, reduce la intensidad de la luz directa, pero lo que es más importante, crea una diferencia de fase artificial de aproximadamente un cuarto de longitud de onda. A medida que las propiedades físicas de esta luz directa han cambiado, se produce una interferencia con la luz difractada, lo que da como resultado la imagen de contraste de fase. Una desventaja de la microscopía de contraste de fases es la formación de halo (anillo de luz halo).

Contraste de interferencia diferencial

Superior y mucho más caro es el uso de contraste de interferencia . Las diferencias en la densidad óptica se mostrarán como diferencias en el relieve. Un núcleo dentro de una célula aparecerá como un glóbulo en el sistema de contraste de interferencia diferencial más utilizado según Georges Nomarski . Sin embargo, debe tenerse en cuenta que se trata de un efecto óptico y que el relieve no se parece necesariamente a la forma real. El contraste es muy bueno y la apertura del condensador se puede utilizar completamente abierta, lo que reduce la profundidad de campo y maximiza la resolución.

El sistema consiste en un prisma especial (prisma Nomarski , prisma Wollaston ) en el condensador que divide la luz en un haz ordinario y uno extraordinario. La diferencia espacial entre los dos haces es mínima (menor que la resolución máxima del objetivo). Después de pasar a través de la muestra, los rayos se reúnen mediante un prisma similar en el objetivo.

En una muestra homogénea, no hay diferencia entre los dos haces y no se genera ningún contraste. Sin embargo, cerca de un límite refractivo (digamos un núcleo dentro del citoplasma), la diferencia entre el haz ordinario y el extraordinario generará un relieve en la imagen. El contraste de interferencia diferencial requiere una fuente de luz polarizada para funcionar; Se deben colocar dos filtros polarizadores en la trayectoria de la luz, uno debajo del condensador (el polarizador) y el otro por encima del objetivo (el analizador).

Nota: En los casos en los que el diseño óptico de un microscopio produce una separación lateral apreciable de los dos haces, tenemos el caso de la microscopía de interferencia clásica , que no da como resultado imágenes en relieve, pero que sin embargo puede utilizarse para la determinación cuantitativa de espesores de masa. de objetos microscópicos.

Reflexión de interferencia

Una técnica adicional que utiliza la interferencia es la microscopía de reflexión de interferencias (también conocida como contraste de interferencia reflejada o RIC). Se basa en la adhesión de las células al portaobjetos para producir una señal de interferencia. Si no hay una celda adherida al vidrio, no habrá interferencia.

La microscopía de reflexión de interferencias se puede obtener utilizando los mismos elementos que utiliza DIC, pero sin los prismas. Además, la luz que se está detectando se refleja y no se transmite como cuando se emplea DIC.

Fluorescencia

Las imágenes también pueden contener artefactos . Ésta es una micrografía de fluorescencia de escaneo láser confocal de la antera del berro (parte del estambre ). La imagen muestra, entre otras cosas, una bonita estructura en forma de collar que fluye de color rojo justo debajo de la antera. Sin embargo, un estambre de berro de thale intacto no tiene tal collar, esto es un artefacto de fijación: el estambre se ha cortado debajo del marco de la imagen y la epidermis (capa superior de células) del tallo del estambre se ha desprendido, formando una estructura no característica. . Foto: Heiti Paves de la Universidad Tecnológica de Tallin .

Cuando ciertos compuestos se iluminan con luz de alta energía, emiten luz de menor frecuencia. Este efecto se conoce como fluorescencia . A menudo, las muestras muestran su imagen de autofluorescencia característica , basada en su composición química.

Este método es de vital importancia en las ciencias de la vida modernas, ya que puede ser extremadamente sensible y permitir la detección de moléculas individuales. Se pueden usar muchos tintes fluorescentes diferentes para teñir diferentes estructuras o compuestos químicos. Un método particularmente poderoso es la combinación de anticuerpos acoplados a un fluoróforo como en la inmunotinción . Los ejemplos de fluoróforos comúnmente usados ​​son la fluoresceína o la rodamina .

Los anticuerpos pueden fabricarse a medida para un compuesto químico. Por ejemplo, una estrategia que se utiliza con frecuencia es la producción artificial de proteínas, basada en el código genético (ADN). Estas proteínas pueden usarse luego para inmunizar conejos, formando anticuerpos que se unen a la proteína. Luego, los anticuerpos se acoplan químicamente a un fluoróforo y se utilizan para rastrear las proteínas en las células en estudio.

Se han desarrollado proteínas fluorescentes de alta eficacia , como la proteína verde fluorescente (GFP), utilizando la técnica de biología molecular de fusión de genes , un proceso que vincula la expresión del compuesto fluorescente con la de la proteína diana. Esta proteína fluorescente combinada es, en general, no tóxica para el organismo y rara vez interfiere con la función de la proteína en estudio. Las células u organismos genéticamente modificados expresan directamente las proteínas marcadas con fluorescencia, lo que permite el estudio de la función de la proteína original in vivo .

El crecimiento de los cristales de proteína da como resultado cristales de proteína y de sal. Ambos son incoloros y microscópicos. La recuperación de los cristales de proteína requiere una formación de imágenes que se puede realizar mediante la fluorescencia intrínseca de la proteína o mediante el uso de microscopía de transmisión. Ambos métodos requieren un microscopio ultravioleta ya que la proteína absorbe luz a 280 nm. La proteína también tendrá fluorescencia a aproximadamente 353 nm cuando se excita con luz de 280 nm.

Dado que la emisión de fluorescencia difiere en longitud de onda (color) de la luz de excitación, una imagen fluorescente ideal muestra solo la estructura de interés que se marcó con el tinte fluorescente. Esta alta especificidad llevó al uso generalizado de la microscopía de luz de fluorescencia en la investigación biomédica. Se pueden usar diferentes tintes fluorescentes para teñir diferentes estructuras biológicas, que luego se pueden detectar simultáneamente, sin dejar de ser específicas debido al color individual del tinte.

Para evitar que la luz de excitación llegue al observador o al detector, se necesitan conjuntos de filtros de alta calidad. Éstos consisten típicamente en un filtro de excitación que selecciona el rango de longitudes de onda de excitación , un espejo dicroico y un filtro de emisión que bloquea la luz de excitación. La mayoría de los microscopios de fluorescencia se operan en el modo de iluminación Epi (iluminación y detección de un lado de la muestra) para disminuir aún más la cantidad de luz de excitación que ingresa al detector.

Ver también: microscopio de fluorescencia de reflexión interna total Neurociencia

Confocal

La microscopía de escaneo láser confocal utiliza un rayo láser enfocado (por ejemplo, 488 nm) que se escanea a través de la muestra para excitar la fluorescencia punto por punto. La luz emitida se dirige a través de un orificio para evitar que la luz desenfocada llegue al detector, normalmente un tubo fotomultiplicador . La imagen se construye en una computadora, trazando las intensidades de fluorescencia medidas de acuerdo con la posición del láser de excitación. En comparación con la iluminación de muestra completa, la microscopía confocal proporciona una resolución lateral ligeramente más alta y mejora significativamente el corte óptico (resolución axial). Por lo tanto, la microscopía confocal se usa comúnmente cuando la estructura 3D es importante.

Una subclase de microscopios confocales son los microscopios de disco giratorio que pueden escanear múltiples puntos simultáneamente a través de la muestra. Un disco correspondiente con orificios rechaza la luz desenfocada. El detector de luz en un microscopio de disco giratorio es una cámara digital, típicamente EM-CCD o sCMOS .

Microscopía de dos fotones

Un microscopio de dos fotones también es un microscopio de escaneo láser, pero en lugar de luz láser UV, azul o verde, se usa un láser infrarrojo pulsado para la excitación. Solo en el pequeño foco del láser la intensidad es lo suficientemente alta como para generar fluorescencia por excitación de dos fotones , lo que significa que no se genera fluorescencia desenfocada y no es necesario un orificio para limpiar la imagen. Esto permite obtener imágenes profundas en tejido disperso, donde un microscopio confocal no podría recolectar fotones de manera eficiente. Los microscopios de dos fotones con detección de campo amplio se utilizan con frecuencia para obtener imágenes funcionales, por ejemplo , imágenes de calcio , en el tejido cerebral. Varias empresas los comercializan como microscopios multifotónicos , aunque las ventajas de utilizar la excitación de 3 fotones en lugar de la de 2 fotones son marginales.

Microscopía de iluminación de plano único y microscopía de fluorescencia de lámina de luz

Usando un plano de luz formado al enfocar la luz a través de una lente cilíndrica en un ángulo estrecho o al escanear una línea de luz en un plano perpendicular al eje del objetivo, se pueden tomar secciones ópticas de alta resolución. La iluminación de un solo plano, o iluminación de hoja de luz, también se logra utilizando técnicas de modelado de haz que incorporan expansores de haz de prismas múltiples . Las imágenes son capturadas por CCD. Estas variantes permiten una captura de imágenes con una relación señal / ruido muy rápida y alta.

Microscopía multifotónica de campo amplio

La microscopía multifotónica de campo amplio se refiere a una técnica de formación de imágenes ópticas no lineales en la que se ilumina una gran área del objeto y se capta la imagen sin necesidad de escanear. Se requieren altas intensidades para inducir procesos ópticos no lineales como la fluorescencia de dos fotones o la generación de segundos armónicos . En los microscopios multifotónicos de barrido, las altas intensidades se consiguen enfocando la luz con precisión y la imagen se obtiene mediante barrido de haz. En la microscopía multifotónica de campo amplio, las altas intensidades se logran mejor utilizando una fuente de láser pulsado amplificado ópticamente para lograr un gran campo de visión (~ 100 µm). La imagen en este caso se obtiene como un solo cuadro con una cámara CCD sin necesidad de escaneo, lo que hace que la técnica sea particularmente útil para visualizar procesos dinámicos simultáneamente en el objeto de interés. Con la microscopía multifotónica de campo amplio, la velocidad de fotogramas se puede aumentar hasta 1000 veces en comparación con la microscopía de barrido multifotónica . Sin embargo, al esparcir tejido, la calidad de la imagen se degrada rápidamente al aumentar la profundidad.

Deconvolución

La microscopía de fluorescencia es una técnica poderosa para mostrar estructuras marcadas específicamente dentro de un entorno complejo y para proporcionar información tridimensional de estructuras biológicas. Sin embargo, esta información se ve borrosa por el hecho de que, tras la iluminación, todas las estructuras marcadas con fluorescencia emiten luz, independientemente de si están enfocadas o no. Entonces, una imagen de una determinada estructura siempre se ve borrosa por la contribución de la luz de estructuras que están desenfocadas. Este fenómeno da como resultado una pérdida de contraste, especialmente cuando se utilizan objetivos con un alto poder de resolución, típicamente objetivos de inmersión en aceite con una alta apertura numérica.

Función de dispersión de puntos modelada matemáticamente de un sistema de imágenes láser THz pulsado.

Sin embargo, el desenfoque no es causado por procesos aleatorios, como la dispersión de la luz, sino que puede definirse bien por las propiedades ópticas de la formación de la imagen en el sistema de formación de imágenes del microscopio. Si se considera una pequeña fuente de luz fluorescente (esencialmente un punto brillante), la luz que proviene de este punto se extiende más lejos desde nuestra perspectiva a medida que el punto se desenfoca más. En condiciones ideales, esto produce una forma de "reloj de arena" de esta fuente puntual en la tercera dimensión (axial). Esta forma se llama función de dispersión puntual (PSF) del sistema de imágenes microscópicas. Dado que cualquier imagen de fluorescencia está formada por un gran número de fuentes de luz fluorescente tan pequeñas, se dice que la imagen está "convolucionada por la función de dispersión puntual". A la derecha se muestra la PSF modelada matemáticamente de un sistema de imágenes pulsadas con láser de terahercios.

La salida de un sistema de imágenes se puede describir mediante la ecuación:

${\ Displaystyle s (x, y) = PSF (x, y) * o (x, y) + n}$

Donde n es el ruido aditivo. Conocer esta función de dispersión puntual significa que es posible revertir este proceso hasta cierto punto mediante métodos informáticos comúnmente conocidos como microscopía de deconvolución . Hay varios algoritmos disponibles para la deconvolución 2D o 3D. Se pueden clasificar en más o menos no reconstituyente y reconstituyentes métodos. Si bien los métodos no restauradores pueden mejorar el contraste al eliminar la luz desenfocada de los planos focales, solo los métodos restauradores pueden reasignar la luz a su lugar de origen adecuado. El procesamiento de imágenes fluorescentes de esta manera puede ser una ventaja sobre la adquisición directa de imágenes sin luz desenfocada, como las imágenes de microscopía confocal , porque las señales de luz eliminadas de otro modo se convierten en información útil. Para la deconvolución 3D, normalmente se proporciona una serie de imágenes tomadas desde diferentes planos focales (llamado pila Z) más el conocimiento de la PSF, que puede derivarse experimental o teóricamente al conocer todos los parámetros que contribuyen al microscopio.

Técnicas de subdifracción

Ejemplo de microscopía de superresolución. Imagen de Her3 y Her2 , diana del fármaco contra el cáncer de mama Trastuzumab , dentro de una célula cancerosa.

En los últimos tiempos se han desarrollado una multitud de técnicas de microscopía de superresolución que eluden el límite de difracción .

Esto se logra principalmente mediante la obtención de imágenes de una muestra suficientemente estática varias veces y modificando la luz de excitación u observando cambios estocásticos en la imagen. Se utilizan los métodos de deconvolución descritos en la sección anterior, que eliminan el desenfoque inducido por PSF y asigna un origen de luz matemáticamente "correcto", aunque con una comprensión ligeramente diferente de lo que significa el valor de un píxel. Suponiendo que la mayor parte del tiempo , un solo fluoróforo contribuye a una sola mancha en una sola imagen tomada, las manchas en las imágenes se pueden reemplazar con su posición calculada, mejorando enormemente la resolución muy por debajo del límite de difracción.

Para realizar tal suposición, el conocimiento y el control químico de la fotofísica de fluoróforos es el núcleo de estas técnicas, mediante las cuales se obtienen regularmente resoluciones de ~ 20 nanómetros.

Microscopía amplificada codificada en tiempo en serie

La microscopía amplificada codificada en tiempo de serie (STEAM) es un método de obtención de imágenes que proporciona una velocidad de obturación y una frecuencia de cuadro ultrarrápidas, mediante el uso de amplificación de imagen óptica para evitar el equilibrio fundamental entre sensibilidad y velocidad, y un fotodetector de un solo píxel para eliminar la necesidad de un Limitaciones de la matriz de detectores y del tiempo de lectura El método es al menos 1000 veces más rápido que las cámaras CCD y CMOS de última generación . En consecuencia, es potencialmente útil para una amplia gama de aplicaciones científicas, industriales y biomédicas que requieren altas tasas de adquisición de imágenes, incluido el diagnóstico y la evaluación en tiempo real de ondas de choque, microfluidos , MEMS y cirugía láser .

Extensiones

La mayoría de los instrumentos modernos ofrecen soluciones sencillas para la microfotografía y la grabación de imágenes de forma electrónica. Sin embargo, estas capacidades no siempre están presentes y el microscopista más experimentado, en muchos casos, todavía preferirá una imagen dibujada a mano a una fotografía. Esto se debe a que un microscopista con conocimiento del tema puede convertir con precisión una imagen tridimensional en un dibujo bidimensional preciso. Sin embargo, en una fotografía u otro sistema de captura de imágenes, solo un plano delgado está bien enfocado.

La creación de micrografías cuidadosas y precisas requiere una técnica microscópica que utiliza un ocular monocular. Es esencial que ambos ojos estén abiertos y que el ojo que no está observando por el microscopio se concentre en una hoja de papel en el banco junto al microscopio. Con la práctica, y sin mover la cabeza o los ojos, es posible registrar con precisión los detalles observados trazando alrededor de las formas observadas "viendo" simultáneamente la punta del lápiz en la imagen microscópica.

La práctica de esta técnica también establece una buena técnica microscópica general. Siempre es menos fatigoso observar con el microscopio enfocado para que la imagen se vea al infinito y con ambos ojos abiertos en todo momento.

Otras mejoras

Microspectroscopia: espectroscopia con microscopio.

radiografía

Como la resolución depende de la longitud de onda de la luz. La microscopía electrónica se ha desarrollado desde la década de 1930 que utiliza haces de electrones en lugar de luz. Debido a la longitud de onda mucho más pequeña del haz de electrones, la resolución es mucho mayor.

Aunque es menos común, la microscopía de rayos X también se ha desarrollado desde finales de la década de 1940. La resolución de la microscopía de rayos X se encuentra entre la de la microscopía óptica y la microscopía electrónica.

Microscopio de electrones

Hasta la invención de la microscopía de sub-difracción, la longitud de onda de la luz limitaba la resolución de la microscopía tradicional a alrededor de 0,2 micrómetros. Para obtener una resolución más alta, en los microscopios electrónicos se utiliza un haz de electrones con una longitud de onda mucho menor.

• La microscopía electrónica de transmisión (TEM) es bastante similar al microscopio óptico compuesto, ya que envía un haz de electrones a través de una porción muy delgada de la muestra. El límite de resolución en 2005 era de alrededor de 0,05 nanómetros y no ha aumentado de forma apreciable desde entonces.
• La microscopía electrónica de barrido (SEM) visualiza los detalles de las superficies de las muestras y ofrece una vista 3D muy agradable. Da resultados muy parecidos a los del microscopio óptico estereoscópico. La mejor resolución para SEM en 2011 fue de 0,4 nanómetros.

Los microscopios electrónicos equipados para espectroscopía de rayos X pueden proporcionar análisis elemental cualitativo y cuantitativo. Este tipo de microscopio electrónico, también conocido como microscopio electrónico analítico, puede ser una herramienta de caracterización muy poderosa para la investigación de nanomateriales.

Microscopía de sonda de barrido

Esta es una técnica de sub-difracción. Ejemplos de microscopios de sonda de barrido son el microscopio de fuerza atómica (AFM), el microscopio de túnel de barrido , el microscopio de fuerza fotónica y el microscopio de seguimiento de recurrencia . Todos estos métodos utilizan el contacto físico de una punta de sonda sólida para escanear la superficie de un objeto, que se supone que es casi plano.

Fuerza ultrasónica

La microscopía de fuerza ultrasónica (UFM) se ha desarrollado para mejorar los detalles y el contraste de la imagen en áreas de interés "planas" donde las imágenes AFM tienen un contraste limitado. La combinación de AFM-UFM permite generar una imagen microscópica acústica de campo cercano. La punta AFM se utiliza para detectar las ondas ultrasónicas y supera la limitación de longitud de onda que se produce en la microscopía acústica. Al usar los cambios elásticos debajo de la punta del AFM, se puede generar una imagen de mucho mayor detalle que la topografía del AFM.

La microscopía de fuerza ultrasónica permite el mapeo local de la elasticidad en microscopía de fuerza atómica mediante la aplicación de vibración ultrasónica al voladizo o muestra. En un intento de analizar los resultados de la microscopía de fuerza ultrasónica de manera cuantitativa, se realiza una medición de la curva de fuerza-distancia con vibración ultrasónica aplicada a la base del voladizo, y los resultados se comparan con un modelo de la dinámica del voladizo y la interacción punta-muestra. basado en la técnica de diferencias finitas.

Microscopía ultravioleta

Los microscopios ultravioleta tienen dos propósitos principales. El primero es utilizar la longitud de onda más corta de la energía electromagnética ultravioleta para mejorar la resolución de la imagen más allá del límite de difracción de los microscopios ópticos estándar. Esta técnica se utiliza para la inspección no destructiva de dispositivos con características muy pequeñas, como las que se encuentran en los semiconductores modernos. La segunda aplicación de los microscopios UV es la mejora del contraste en la que se mejora la respuesta de las muestras individuales, en relación con su entorno, debido a la interacción de la luz con las moléculas dentro de la propia muestra. Un ejemplo es el crecimiento de cristales de proteínas . Los cristales de proteína se forman en soluciones salinas. Como los cristales de sal y de proteína se forman en el proceso de crecimiento, y ambos son comúnmente transparentes para el ojo humano, no se pueden diferenciar con un microscopio óptico estándar. Como el triptófano de la proteína absorbe luz a 280 nm, la obtención de imágenes con un microscopio UV con filtros de paso de banda de 280 nm facilita la diferenciación entre los dos tipos de cristales. Los cristales de proteína aparecen oscuros mientras que los cristales de sal son transparentes.

Microscopía infrarroja

El término microscopía infrarroja se refiere a la microscopía realizada en longitudes de onda infrarrojas . En la configuración típica del instrumento, un espectrómetro de infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR) se combina con un microscopio óptico y un detector de infrarrojos . El detector de infrarrojos puede ser un detector de un solo punto, una matriz lineal o una matriz de plano focal 2D. FTIR proporciona la capacidad de realizar análisis químicos a través de espectroscopía infrarroja y el microscopio y el detector puntual o de matriz permiten que este análisis químico se resuelva espacialmente, es decir, que se realice en diferentes regiones de la muestra. Como tal, la técnica también se llama microespectroscopía infrarroja. Una arquitectura alternativa llamada Imágenes infrarrojas directas con láser (LDIR) implica la combinación de una fuente de luz infrarroja sintonizable y un detector de un solo punto en un objetivo volador). Esta técnica se usa con frecuencia para imágenes químicas infrarrojas , donde el contraste de la imagen se determina por la respuesta de regiones de muestra individuales a longitudes de onda de IR particulares seleccionadas por el usuario, generalmente bandas de absorción de IR específicas y resonancias moleculares asociadas . Una limitación clave de la microespectroscopía infrarroja convencional es que la resolución espacial está limitada por difracción . Específicamente, la resolución espacial se limita a una figura relacionada con la longitud de onda de la luz. Para los microscopios IR prácticos, la resolución espacial se limita a 1-3 veces la longitud de onda, según la técnica y el instrumento específicos utilizados. Para longitudes de onda de infrarrojo medio, esto establece un límite de resolución espacial práctica de ~ 3-30 μm.

También existen versiones IR de microscopía de sub-difracción. Estos incluyen microscopio óptico de barrido de campo cercano IR (NSOM) , microspectroscopia fototérmica y espectroscopia infrarroja basada en microscopio de fuerza atómica (AFM-IR) , así como microscopía óptica de campo cercano de barrido de tipo dispersión (s-SNOM) y nano-FTIR que proporcionan resolución espacial a nanoescala en longitudes de onda IR.

Microscopía holográfica digital

Células humanas obtenidas por imágenes por cambio de fase DHM (izquierda) y microscopía de contraste de fase (derecha).

En microscopía holográfica digital (DHM), los frentes de onda interferentes de una fuente de luz coherente (monocromática) se registran en un sensor. La imagen es reconstruida digitalmente por una computadora a partir del holograma grabado . Además de la imagen de campo brillante normal, se crea una imagen de cambio de fase .

DHM puede funcionar tanto en modo de reflexión como de transmisión. En el modo de reflexión, la imagen de cambio de fase proporciona una medición de distancia relativa y, por lo tanto, representa un mapa topográfico de la superficie reflectante. En el modo de transmisión, la imagen de cambio de fase proporciona una medición cuantitativa sin etiquetas del espesor óptico de la muestra. Las imágenes de cambio de fase de células biológicas son muy similares a las imágenes de células teñidas y han sido analizadas con éxito por software de análisis de alto contenido .

Una característica única de DHM es la capacidad de ajustar el enfoque después de grabar la imagen, ya que el holograma registra todos los planos de enfoque simultáneamente. Esta característica permite visualizar partículas en movimiento en un volumen o escanear rápidamente una superficie. Otra característica atractiva es la capacidad de DHM de utilizar ópticas de bajo costo mediante la corrección de las aberraciones ópticas mediante software.

Patología digital (microscopía virtual)

La patología digital es un entorno de información basado en imágenes habilitado por tecnología informática que permite la gestión de la información generada a partir de una diapositiva digital. La patología digital está habilitada en parte por la microscopía virtual , que es la práctica de convertir portaobjetos de vidrio en portaobjetos digitales que se pueden ver, administrar y analizar.

Microscopía láser

La microscopía láser es un campo en rápido crecimiento que utiliza fuentes de iluminación láser en diversas formas de microscopía. Por ejemplo, la microscopía láser centrada en aplicaciones biológicas utiliza láseres de pulso ultracorto , en una serie de técnicas etiquetadas como microscopía no lineal, microscopía de saturación y microscopía de excitación de dos fotones .

Los láseres de rayos X de laboratorio de alta intensidad y pulso corto se han estado desarrollando durante varios años. Cuando esta tecnología se materialice, será posible obtener imágenes tridimensionales ampliadas de estructuras biológicas elementales en estado de vida en un instante definido con precisión. Para un contraste óptimo entre el agua y las proteínas y para una mejor sensibilidad y resolución, el láser debe ajustarse cerca de la línea de nitrógeno a aproximadamente 0,3 nanómetros. La resolución estará limitada principalmente por la expansión hidrodinámica que se produce mientras se registra el número necesario de fotones. Así, mientras la muestra es destruida por la exposición, su configuración puede capturarse antes de que explote.

Los científicos han estado trabajando en diseños prácticos y prototipos para microscopios holográficos de rayos X, a pesar del desarrollo prolongado del láser apropiado.

Microscopía fotoacústica

Una técnica de microscopía que se basa en el efecto fotoacústico , es decir, la generación de (ultra) sonido provocado por la absorción de la luz. Un rayo láser enfocado y de intensidad modulada se escanea por trama sobre una muestra. El (ultra) sonido generado se detecta mediante un transductor de ultrasonido. Comúnmente, se emplean transductores de ultrasonidos piezoeléctricos.

El contraste de la imagen está relacionado con el coeficiente de absorción de la muestra . Esto contrasta con la microscopía de campo brillante u oscuro, donde el contraste de la imagen se debe a la transmitancia o la dispersión. En principio, el contraste de la microscopía de fluorescencia también es proporcional a la absorción de la muestra. Sin embargo, en la microscopía de fluorescencia, el rendimiento cuántico de fluorescencia debe ser diferente de cero para que se pueda detectar una señal. En microscopía fotoacústica, sin embargo, cada sustancia absorbente da una señal fotoacústica que es proporcional a ${\ Displaystyle \ alpha}$${\ Displaystyle \ eta _ {fl}}$${\ Displaystyle PA}$

${\ Displaystyle PA \ propto \ alpha * \ Gamma * ((1- \ eta _ {fl}) * E_ {g} + (E_ {láser} -E_ {g}))}$

Aquí está el coeficiente de Grüneisen, es la energía del fotón del láser y es la energía de la banda prohibida de la muestra. Por lo tanto, la microscopía fotoacústica parece muy adecuada como técnica complementaria a la microscopía de fluorescencia, ya que un alto rendimiento cuántico de fluorescencia conduce a altas señales de fluorescencia y un bajo rendimiento cuántico de fluorescencia conduce a altas señales fotoacústicas. ${\ Displaystyle \ Gamma}$${\ displaystyle E_ {láser}}$${\ Displaystyle E_ {g}}$

Sin tener en cuenta los efectos no lineales, la resolución lateral dx está limitada por el límite de difracción de Abbe :

${\ displaystyle dx = \ lambda / (2 * NA)}$

donde es la longitud de onda del láser de excitación y NA es la apertura numérica de la lente del objetivo. El límite de difracción de Abbe se mantiene si el frente de onda entrante es paralelo. En realidad, sin embargo, el perfil del rayo láser es gaussiano. Por lo tanto, para calcular la resolución alcanzable, deben usarse fórmulas para haces gaussianos truncados. ${\ Displaystyle \ lambda}$

Microscopía amateur

La microscopía amateur es la investigación y observación de especímenes biológicos y no biológicos con fines recreativos. Los recolectores de minerales , insectos , conchas marinas y plantas pueden usar microscopios como herramientas para descubrir características que les ayuden a clasificar los elementos recolectados. Otros aficionados pueden estar interesados ​​en observar la vida que se encuentra en el agua del estanque y en otras muestras. Los microscopios también pueden resultar útiles para la evaluación de la calidad del agua para las personas que tienen un acuario en casa . La documentación fotográfica y el dibujo de las imágenes microscópicas son tareas adicionales que aumentan el espectro de tareas del aficionado. Incluso hay concursos de arte de microfotografía . Los participantes de este pasatiempo pueden utilizar portaobjetos microscópicos preparados comercialmente o participar en la tarea de preparación de muestras.

Si bien la microscopía es una herramienta central en la documentación de especímenes biológicos, en general es insuficiente para justificar la descripción de una nueva especie basándose únicamente en investigaciones microscópicas. A menudo, las pruebas genéticas y bioquímicas son necesarias para confirmar el descubrimiento de una nueva especie. Un laboratorio y el acceso a la literatura académica es una necesidad, que está especializada y, en general, no al alcance de los aficionados. Sin embargo, hay una gran ventaja que los aficionados tienen por encima de los profesionales: tiempo para explorar sus alrededores. A menudo, los aficionados avanzados se asocian con profesionales para validar sus hallazgos y (posiblemente) describir nuevas especies.

A fines del siglo XIX, la microscopía de aficionados se convirtió en un pasatiempo popular en los Estados Unidos y Europa. Los filántropos estaban pagando a varios 'aficionados profesionales' por sus viajes de muestreo y exploraciones microscópicas, para que se divirtieran el domingo por la tarde (por ejemplo, el especialista en diatomeas A. Grunow, pagado por (entre otros) un industrial belga). El profesor John Phin publicó "Consejos prácticos sobre la selección y el uso del microscopio (segunda edición, 1878)" y también fue editor del "American Journal of Microscopy".

Ejemplos de imágenes de microscopía de aficionados:

• 

  Boca de "abeja casera" 100X

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  Tallo de arroz cs 400X

• 

  Testículo de conejo 100X

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  Helecho Prothallium 400X

Aplicación en ciencia forense

La microscopía tiene muchas aplicaciones en las ciencias forenses; proporciona precisión, calidad, exactitud y reproducibilidad de resultados. Estas aplicaciones son casi ilimitadas. Esto se debe a la capacidad del microscopio para detectar, resolver y obtener imágenes de los elementos de evidencia más pequeños, a menudo sin ninguna alteración o destrucción. El microscopio se utiliza para identificar y comparar fibras, pelos, suelos y polvo ... etc.

El objetivo de cualquier microscopio es ampliar imágenes o fotografías de un objeto pequeño y ver detalles finos. En forense; el tipo de muestra, la información que se desea obtener de ella y el tipo de microscopio elegido para la tarea determinarán si la preparación de la muestra es necesaria. Por ejemplo, líneas de tinta, manchas de sangre o balas, no se requiere tratamiento y la evidencia se muestra directamente del microscopio apropiado sin ningún tipo de preparación de la muestra, pero para trazas de materia en particular, la preparación de la muestra debe realizarse antes de que ocurra el examen microscópico.

En el laboratorio de ciencias forenses se utilizan diversos microscopios. Los microscopios de luz son los más utilizados en medicina forense y estos microscopios usan fotones para formar imágenes ⁴ , estos microscopios que son más aplicables para examinar muestras forenses como se mencionó anteriormente son los siguientes:

1. El microscopio compuesto

2. El microscopio de comparación

3. El microscopio estereoscópico

4. El microscopio polarizador

5. El microespectrofotómetro

Esta diversidad de tipos de microscopios en aplicaciones forenses proviene principalmente de sus rangos de aumento, que son (1- 1200X), (50 -30,000X) y (500-250,000X) para microscopía óptica, SEM y TEM respectivamente.

Ver también

Referencias

Otras lecturas

enlaces externos

General

• Glosario de microscopía , términos comunes utilizados en microscopía óptica de aficionados.
• Nikon MicroscopyU Amplia información sobre microscopía óptica
• Centro de recursos de microscopía de microscopía de Olympus
• Carl Zeiss "Microscopía desde el principio" , un tutorial paso a paso sobre los conceptos básicos de la microscopía.
• Microscopía en detalle : un recurso con muchas ilustraciones que elaboran las técnicas de microscopía más comunes.
• Microscopía Manawatu : primer entorno de colaboración conocido para microscopía y análisis de imágenes.
• Glosario de microscopio de audio

Técnicas

• Aplicaciones de imágenes de relación métrica para microscopios Ejemplos de trabajo de imágenes radiométricas en un microscopio
• Base de datos interactiva de tintes y filtros de fluorescencia Carl Zeiss Base de datos interactiva de tintes y filtros de fluorescencia.
• Nuevos enfoques de la microscopía Eric Betzig: más allá del Premio Nobel: nuevos enfoques de la microscopía.