Polimerasa Taq - Taq polymerase
| ADN polimerasa I, termoestable | |||||||
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 Fragmento grande (Klenow) de Taq polA, que contiene los dominios polA y vestigial
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| Identificadores | |||||||
| Organismo | |||||||
| Símbolo | polA | ||||||
| UniProt | P19821 | ||||||
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La polimerasa Taq es una ADN polimerasa termoestable que recibí el nombre delmicroorganismo eubacteriano termófilo Thermus aquaticus , del cual fue aislada originalmente por Chien et al. en 1976. Su nombre a menudo se abrevia como Taq o Taq pol . Se utiliza con frecuencia en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), un método para amplificar en gran medida la cantidad de segmentos cortos de ADN .
T. aquaticus es una bacteria que vive en fuentes termales y respiraderos hidrotermales , y la polimerasa Taq fue identificada como una enzima capaz de resistir las condiciones de desnaturalización de proteínas (alta temperatura) requeridas durante la PCR. Por lo tanto, reemplazó la ADN polimerasa de E. coli utilizada originalmente en la PCR.
Propiedades enzimáticas
La temperatura óptima de actividad de Taq es de 75 a 80 ° C, con una vida media de más de 2 horas a 92,5 ° C, 40 minutos a 95 ° C y 9 minutos a 97,5 ° C, y puede replicar un par de bases de 1000 hebra de ADN en menos de 10 segundos a 72 ° C. A 75-80 ° C, Taq alcanza su tasa de polimerización óptima de aproximadamente 150 nucleótidos por segundo por molécula de enzima, y cualquier desviación del rango de temperatura óptima inhibe la tasa de extensión de la enzima. Una sola Taq sintetiza aproximadamente 60 nucleótidos por segundo a 70 ° C, 24 nucleótidos / seg a 55 ° C, 1,5 nucleótidos / seg a 37 ° C y 0,25 nucleótidos / seg a 22 ° C. A temperaturas superiores a 90 ° C, Taq demuestra muy poca o ninguna actividad, pero la enzima en sí no se desnaturaliza y permanece intacta. La presencia de ciertos iones en el recipiente de reacción también afecta la actividad específica de la enzima. Pequeñas cantidades de cloruro de potasio (KCl) e iones de magnesio (Mg 2+ ) promueven la actividad enzimática de Taq . La polimerasa Taq se activa al máximo con KCl 50 mM y la concentración justa de Mg 2+ que se determina mediante la concentración de trifosfatos de nucleósidos (dNTP). Las altas concentraciones de KCl y Mg 2+ inhiben la actividad de Taq . Curiosamente, el quelante de iones metálicos común, EDTA , se une directamente a Taq en ausencia de estos iones metálicos.
Uno de los inconvenientes de Taq es su falta de actividad de corrección de pruebas de exonucleasa 3 ' a 5' , lo que da como resultado una fidelidad de replicación relativamente baja. Originalmente, su tasa de error se midió en aproximadamente 1 en 9.000 nucleótidos. Algunas ADN polimerasas termoestables se han aislado de otras bacterias termófilas y arqueas, como la ADN polimerasa Pfu , que posee una actividad de corrección de pruebas, y se utilizan en lugar de (o en combinación con) Taq para la amplificación de alta fidelidad. La fidelidad puede variar mucho entre Taq, lo que tiene profundos efectos en las aplicaciones de secuenciación descendente.
Taq fabrica productos de ADN que tienen proyecciones de A ( adenina ) en sus extremos 3 '. Esto puede ser útil en la clonación de TA , mediante el cual se utiliza un vector de clonación (como un plásmido ) que tiene una proyección 3 'de T ( timina ), que se complementa con la proyección A del producto de PCR, lo que permite la ligación del producto de PCR en el vector plásmido.
En PCR
A principios de la década de 1980, Kary Mullis trabajaba en Cetus Corporation en la aplicación de ADN sintéticos a la biotecnología . Estaba familiarizado con el uso de oligonucleótidos de ADN como sondas para la unión a cadenas de ADN diana, así como su uso como cebadores para la secuenciación de ADN y la síntesis de ADNc . En 1983, comenzó a usar dos cebadores, uno para hibridar con cada hebra de un ADN objetivo y agregar ADN polimerasa a la reacción. Esto condujo a una replicación exponencial del ADN , amplificando en gran medida segmentos discretos de ADN entre los cebadores.
Sin embargo, después de cada ronda de replicación, la mezcla debe calentarse por encima de 90 ° C para desnaturalizar el ADN recién formado, permitiendo que las hebras se separen y actúen como plantillas en la siguiente ronda de amplificación. Este paso de calentamiento también inactiva la ADN polimerasa que estaba en uso antes del descubrimiento de la polimerasa Taq , el fragmento de Klenow (procedente de E. coli ). La polimerasa Taq es muy adecuada para esta aplicación porque es capaz de soportar la temperatura de 95 ° C que se requiere para la separación de la cadena de ADN sin desnaturalizar.
El uso de Taq termoestable permite ejecutar la PCR a alta temperatura (~ 60 ° C y más), lo que facilita una alta especificidad de los cebadores y reduce la producción de productos no específicos, como el dímero de cebadores . Además, el uso de una polimerasa termoestable elimina la necesidad de agregar una nueva enzima a cada ciclo de termociclado. Se puede utilizar un solo tubo cerrado en una máquina relativamente sencilla para llevar a cabo todo el proceso. Por lo tanto, el uso de la polimerasa Taq fue la idea clave que hizo que la PCR fuera aplicable a una gran variedad de problemas de biología molecular relacionados con el análisis de ADN.
Problemas de patentes
Hoffmann-La Roche finalmente compró las patentes de PCR y Taq de Cetus por $ 330 millones, de los cuales pudo haber recibido hasta $ 2 mil millones en regalías. En 1989, Science Magazine nombró a la polimerasa Taq como su primera " Molécula del año ". Kary Mullis recibió el Premio Nobel de Química en 1993, el único otorgado por investigaciones realizadas en una empresa de biotecnología . A principios de la década de 1990, la técnica de PCR con Taq se estaba utilizando polimerasa en muchas áreas, incluyendo la investigación básica biología molecular, pruebas clínicas , y medicina forense . También comenzó a encontrar una aplicación urgente en la detección directa del VIH en el SIDA .
En diciembre de 1999, el juez federal de distrito Vaughn Walker dictaminó que la patente de 1990 que involucraba la polimerasa Taq se emitió, en parte, por información engañosa y afirmaciones falsas de científicos de Cetus Corporation . El fallo apoyó una impugnación de Promega Corporation contra Hoffman-La Roche , que compró las patentes de Taq en 1991. El juez Walker citó descubrimientos anteriores de otros laboratorios, incluido el laboratorio del profesor John Trela en el departamento de ciencias biológicas de la Universidad de Cincinnati , como el base de la sentencia.
Estructura de dominio
| Taq polimerasa, exonucleasa | |||||||||
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 ADN polimerasa de Taq completa unida a un octámero de ADN
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| Identificadores | |||||||||
| Símbolo | Taq-exonuc | ||||||||
| Pfam | PF09281 | ||||||||
| InterPro | IPR015361 | ||||||||
| SCOP2 | 1qtm / SCOPe / SUPFAM | ||||||||
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Taq PolA tiene una estructura general similar a la de E. coli PolA. El dominio de exonucleasa 3'-5 'central responsable de la corrección de pruebas ha cambiado drásticamente y no es funcional. Tiene un dominio de exonucleasa 5'-3 'funcional en el terminal amino, que se describe a continuación. Los dos dominios restantes actúan en coordinación, a través del movimiento de dominio acoplado.
Dominio de exonucleasa
La exonucleasa de la polimerasa Taq es un dominio que se encuentra en el extremo amino de la ADN polimerasa Ide Taq (termoestable). Supone una ribonucleasa H-como adorno . El dominio confiereactividad exonucleasa 5 ' -3' a la polimerasa.
A diferencia del mismo dominio en E. coli , que degradaría los cebadores y debe eliminarse mediante digestión para el uso de PCR, no se dice que este dominio degrade el cebador. Esta actividad se utiliza en la sonda TaqMan : a medida que se forman las hebras hijas, las sondas complementarias a la plantilla entran en contacto con la polimerasa y se escinden en trozos fluorescentes.
Unión con ADN
La polimerasa Taq está unida en su hendidura del sitio activo de la polimerasa con el extremo romo del ADN dúplex. Cuando la polimerasa Taq está en contacto con el ADN unido, sus cadenas laterales forman enlaces de hidrógeno con las purinas y pirimidinas del ADN. La misma región de la polimerasa Taq que se ha unido al ADN también se une a la exonucleasa. Estas estructuras unidas a la polimerasa Taq tienen diferentes interacciones.
Mutantes
Se ha informado de un experimento de mutagénesis dirigida al sitio que mejora la actividad de la exonucleasa vestigal 3'-5 'en un factor de 2, pero nunca se informó si al hacerlo se reduce la tasa de error. Siguiendo una línea de pensamiento similar, las proteínas quimeras se han elaborado seleccionando dominios de E. coli , Taq y T. neapolitana polimerasa I. Al intercambiar el dominio vestigal por uno funcional de E. coli se creó una proteína con prueba capacidad de lectura pero una temperatura óptima más baja y baja termoestabilidad.
Se han producido versiones de la polimerasa sin el dominio de exonucleasa 5'-3 ', entre las que se conocen mejor Klentaq o el fragmento Stoffel . La completa falta de actividad exonucleasa hace que estas variantes sean adecuadas para cebadores que exhiben una estructura secundaria así como para copiar moléculas circulares. Otras variaciones incluyen el uso de Klentaq con una polimerasa de alta fidelidad, una Termosecuenasa que reconoce sustratos como lo hace la ADN polimerasa T7 , mutantes con mayor tolerancia a los inhibidores o versiones "etiquetadas con dominio" que tienen un motivo extra de hélice-horquilla-hélice alrededor del catalizador. sitio para sujetar el ADN con más fuerza a pesar de las condiciones adversas.
Importancia en la detección de enfermedades
Debido a las mejoras que proporciona la polimerasa Taq en la replicación del ADN por PCR: mayor especificidad, menos productos inespecíficos y procesos y equipos más simples, ha sido fundamental en los esfuerzos realizados para detectar enfermedades. "El uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en el diagnóstico de enfermedades infecciosas ha dado como resultado la capacidad de diagnosticar temprano y tratar adecuadamente las enfermedades debidas a patógenos exigentes, determinar la susceptibilidad antimicrobiana de organismos de crecimiento lento y determinar la cantidad de infección". La implementación de la polimerasa Taq ha salvado innumerables vidas. Ha desempeñado un papel fundamental en la detección de muchas de las peores enfermedades del mundo, entre ellas: tuberculosis, faringitis estreptocócica, neumonía atípica, sida, sarampión, hepatitis e infecciones urogenitales ulcerativas. La PCR, el método utilizado para recrear copias de muestras de ADN específicas, hace posible la detección de enfermedades al dirigirse a una secuencia de ADN específica de un patógeno específico de la muestra de un paciente y amplificar trazas de las secuencias indicativas al copiarlas hasta miles de millones de veces. Aunque este es el método más preciso de detección de enfermedades, especialmente para el VIH, no se realiza con tanta frecuencia como pruebas alternativas inferiores debido al costo, la mano de obra y el tiempo relativamente altos que se requieren.
La dependencia de la polimerasa Taq como catalizador para el proceso de replicación por PCR se destacó durante la pandemia COVID-19 de 2020. La escasez de la enzima necesaria ha afectado la capacidad de los países de todo el mundo para producir kits de prueba para el virus. Sin la polimerasa Taq , el proceso de detección de enfermedades es mucho más lento y tedioso.
A pesar de las ventajas de utilizar la polimerasa Taq en la detección de enfermedades por PCR, la enzima no está exenta de deficiencias. Enfermedades retrovirales: VIH, HTLV-1 y HTLV-II; a menudo incluyen mutaciones de guanina a adenina en su genoma. Mutaciones como estas son las que permiten que las pruebas de PCR detecten las enfermedades, pero la tasa de fidelidad relativamente baja de la polimerasa Taq hace que se produzca la misma mutación G-a-A y posiblemente arroje un resultado de prueba falso positivo.
