Electroporación - Electroporation
La electroporación , o electropermeabilización , es una técnica de microbiología en la que se aplica un campo eléctrico a las células para aumentar la permeabilidad de la membrana celular , permitiendo que se introduzcan en la célula productos químicos, fármacos, conjuntos de electrodos o ADN (también llamado electrotransferencia ). En microbiología, el proceso de electroporación se usa a menudo para transformar bacterias , levaduras o protoplastos de plantas mediante la introducción de un nuevo ADN codificante. Si las bacterias y los plásmidos se mezclan, los plásmidos se pueden transferir a las bacterias después de la electroporación, aunque, dependiendo de lo que se transfiera, también se podrían usar péptidos que penetran en las células o CellSqueeze . La electroporación funciona pasando miles de voltios (~ 8 kV / cm) a través de células suspendidas en una cubeta de electroporación. Posteriormente, las células deben manipularse con cuidado hasta que hayan tenido la oportunidad de dividirse, produciendo nuevas células que contengan plásmidos reproducidos. Este proceso es aproximadamente diez veces más eficaz que la transformación química.
La electroporación también es muy eficaz para la introducción de genes extraños en células de cultivo de tejidos, especialmente células de mamíferos . Por ejemplo, se utiliza en el proceso de producción de ratones knockout , así como en el tratamiento de tumores, la terapia génica y la terapia celular. El proceso de introducción de ADN extraño en células eucariotas se conoce como transfección . La electroporación es muy eficaz para transfectar células en suspensión utilizando cubetas de electroporación. La electroporación ha demostrado ser eficaz para su uso en tejidos in vivo, para aplicaciones en el útero, así como para la transfección in ovo. Las células adherentes también se pueden transfectar mediante electroporación, lo que proporciona a los investigadores una alternativa a la tripsinización de sus células antes de la transfección. Sin embargo, una desventaja de la electroporación es que después del proceso, la expresión génica de más de 7.000 genes puede verse afectada. Esto puede causar problemas en estudios en los que la expresión génica debe controlarse para garantizar resultados precisos y precisos.
Aunque la electroporación a granel tiene muchos beneficios sobre los métodos de administración física, como las microinyecciones y las pistolas de genes , todavía tiene limitaciones, incluida la baja viabilidad celular. Se ha estudiado la miniaturización de la electroporación, lo que conduce a la microelectroporación y nanotransfección de tejido utilizando técnicas basadas en la electroporación a través de nanocanales para entregar carga mínimamente invasiva a las células.
La electroporación también se ha utilizado como mecanismo para desencadenar la fusión celular . La fusión celular inducida artificialmente se puede utilizar para investigar y tratar diferentes enfermedades, como la diabetes, regenerar los axones del sistema nervioso central y producir células con las propiedades deseadas, como en las vacunas celulares para la inmunoterapia contra el cáncer. Sin embargo, la primera y más conocida aplicación de la fusión celular es la producción de anticuerpos monoclonales en la tecnología de hibridomas , donde se forman líneas celulares híbridas (hibridomas) fusionando linfocitos B productores de anticuerpos específicos con una línea celular de mieloma (cáncer de linfocitos B).
Práctica de laboratorio
La electroporación se realiza con electroporadores , aparatos especialmente diseñados que crean un campo electrostático en una solución de celda. La suspensión celular se pipetea en una cubeta de vidrio o plástico que tiene dos electrodos de aluminio en sus lados. Para la electroporación bacteriana, se usa típicamente una suspensión de alrededor de 50 microlitros . Antes de la electroporación, esta suspensión de bacterias se mezcla con el plásmido a transformar. La mezcla se pipetea en la cubeta, se ajustan el voltaje y la capacitancia, y la cubeta se inserta en el electroporador. El proceso requiere un contacto directo entre los electrodos y la suspensión. Inmediatamente después de la electroporación, se agrega un mililitro de medio líquido a las bacterias (en la cubeta o en un tubo Eppendorf ) y el tubo se incuba a la temperatura óptima de las bacterias durante una hora o más para permitir la recuperación de las células y la expresión de la plásmido, seguido de cultivo bacteriano en placas de agar .
El éxito de la electroporación depende en gran medida de la pureza de la solución de plásmido, especialmente de su contenido de sal. Las soluciones con altas concentraciones de sal pueden causar una descarga eléctrica (conocida como arco ), que a menudo reduce la viabilidad de las bacterias. Para una investigación más detallada del proceso, se debe prestar más atención a la impedancia de salida del dispositivo porador y la impedancia de entrada de la suspensión de células (por ejemplo , contenido de sal ).
Dado que la membrana celular no puede pasar corriente (excepto en los canales iónicos), actúa como un condensador eléctrico. Someter las membranas a un campo eléctrico de alto voltaje da como resultado su ruptura temporal, lo que da como resultado poros que son lo suficientemente grandes como para permitir que las macromoléculas (como el ADN) entren o salgan de la célula.
Además, la electroporación se puede utilizar para aumentar la permeabilidad de las células durante las inyecciones y cirugías en el útero. En particular, la electroporación permite una transfección más eficiente de ADN, ARN, shRNA y todos los ácidos nucleicos en las células de ratones y ratas. El éxito de la electroporación in vivo depende en gran medida del voltaje, la repetición, los pulsos y la duración. Los sistemas nerviosos centrales en desarrollo son más efectivos para la electroporación in vivo debido a la visibilidad de los ventrículos para las inyecciones de ácidos nucleicos, así como al aumento de la permeabilidad de las células en división. La electroporación de embriones inyectados en el útero se realiza a través de la pared del útero, a menudo con electrodos tipo fórceps para limitar el daño al embrión.
Estudios in vitro y en animales
La electrotransferencia de genes in vivo se describió por primera vez en 1991 y en la actualidad existen muchos estudios preclínicos sobre la electrotransferencia de genes. El método se utiliza para entregar una gran variedad de genes terapéuticos para el tratamiento potencial de varias enfermedades, tales como: trastornos del sistema inmunológico, tumores, trastornos metabólicos, enfermedades monogenéticas, enfermedades cardiovasculares, analgesia….
Con respecto a la electroporación irreversible, el primer tratamiento exitoso de tumores cutáneos malignos implantados en ratones fue completado en 2007 por un grupo de científicos que logró la ablación tumoral completa en 12 de 13 ratones. Lo lograron enviando 80 pulsos de 100 microsegundos a 0,3 Hz con una magnitud de campo eléctrico de 2500 V / cm para tratar los tumores cutáneos. Actualmente, varias empresas, incluidas AngioDynamics, Inc. y VoltMed, Inc., continúan desarrollando e implementando tecnologías irreversibles basadas en electroporación en entornos clínicos.
El primer grupo que estudió la electroporación para aplicaciones médicas fue dirigido por Lluis M Mir en el Instituto Gustave Roussy. En este caso, analizaron el uso de electroporación reversible junto con macromoléculas impermeables. La primera investigación que analizó cómo los pulsos de nanosegundos podrían usarse en células humanas fue realizada por investigadores de la Facultad de Medicina de Eastern Virginia y la Universidad Old Dominion , y publicada en 2003.
Aplicaciones médicas
La primera aplicación médica de la electroporación se utilizó para introducir fármacos contra el cáncer de baja permeabilidad en los nódulos tumorales. Pronto también la electrotransferencia de genes se volvió de especial interés debido a su bajo costo, facilidad de realización y seguridad. Es decir, los vectores virales pueden tener serias limitaciones en términos de inmunogenicidad y patogenicidad cuando se utilizan para la transferencia de ADN.
Se encontró un voltaje más alto de electroporación en los cerdos para destruir irreversiblemente las células diana dentro de un rango estrecho sin afectar las células vecinas, y por lo tanto representa un nuevo tratamiento prometedor para el cáncer, las enfermedades cardíacas y otras enfermedades que requieren la extracción de tejido. Desde entonces, la electroporación irreversible (IRE) ha demostrado su eficacia en el tratamiento del cáncer humano, y los cirujanos de Johns Hopkins y otras instituciones ahora utilizan la tecnología para tratar el cáncer de páncreas que antes se pensaba que era irresecable.
También se informó sobre el primer ensayo clínico de fase I de electrotransferencia de genes en pacientes con melanoma metastásico. Se realizó el suministro mediado por electroporación de un gen que codifica el plásmido para la interleucina-12 (pIL-12) y se controló la seguridad, la tolerabilidad y el efecto terapéutico. El estudio concluyó que la electrotransferencia de genes con pIL-12 es segura y bien tolerada. Además, también se observó una respuesta parcial o completa en metástasis distantes no tratadas, lo que sugiere el efecto del tratamiento sistémico. Con base en estos resultados, ya están planeando pasar al estudio clínico de Fase II. Actualmente existen varios estudios clínicos en curso de electrotransferencia de genes, donde se monitorea la seguridad, tolerabilidad y efectividad de la inmunización con la vacuna de ADN, que es administrada por pulsos eléctricos.
Aunque el método no es sistémico, sino estrictamente local, sigue siendo la estrategia no viral más eficaz para la entrega de genes.
N-TIRE
Una técnica reciente llamada electroporación irreversible no térmica (N-TIRE) ha demostrado su eficacia en el tratamiento de muchos tipos diferentes de tumores y otros tejidos no deseados. Este procedimiento se realiza utilizando pequeños electrodos (de aproximadamente 1 mm de diámetro), colocados dentro o alrededor del tejido objetivo para aplicar ráfagas cortas y repetitivas de electricidad a un voltaje y frecuencia predeterminados. Estas ráfagas de electricidad aumentan el potencial transmembrana en reposo (TMP), por lo que se forman nanoporos en la membrana plasmática. Cuando la electricidad aplicada al tejido está por encima del umbral del campo eléctrico del tejido objetivo, las células se vuelven permanentemente permeables debido a la formación de nanoporos. Como resultado, las células no pueden reparar el daño y mueren debido a una pérdida de homeostasis. N-TIRE es exclusivo de otras técnicas de ablación de tumores en el sentido de que no crea daño térmico en el tejido que lo rodea.
Electroporación reversible
Por el contrario, la electroporación reversible se produce cuando la electricidad aplicada con los electrodos está por debajo del umbral del campo eléctrico del tejido diana. Debido a que la electricidad aplicada está por debajo del umbral de las células, permite que las células repare su bicapa de fosfolípidos y continúen con sus funciones celulares normales. La electroporación reversible generalmente se realiza con tratamientos que implican la introducción de un fármaco o gen (u otra molécula que normalmente no es permeable a la membrana celular) en la célula. No todos los tejidos tienen el mismo umbral de campo eléctrico; por lo tanto, se deben realizar cálculos cuidadosos antes de un tratamiento para garantizar la seguridad y la eficacia.
Una de las principales ventajas de usar N-TIRE es que, cuando se realiza correctamente de acuerdo con cálculos cuidadosos, solo afecta al tejido objetivo. Las proteínas, la matriz extracelular y las estructuras críticas como los vasos sanguíneos y los nervios no se ven afectadas y quedan sanas por este tratamiento. Esto permite una recuperación más rápida y facilita un reemplazo más rápido de las células tumorales muertas por células sanas.
Antes de realizar el procedimiento, los científicos deben calcular cuidadosamente exactamente lo que se debe hacer y tratar a cada paciente de forma individual, caso por caso. Para hacer esto, la tecnología de imágenes como las tomografías computarizadas y las resonancias magnéticas se utilizan comúnmente para crear una imagen 3D del tumor. A partir de esta información, pueden aproximar el volumen del tumor y decidir el mejor curso de acción, incluido el sitio de inserción de los electrodos, el ángulo en el que se insertan, el voltaje necesario y más, utilizando tecnología de software. A menudo, se usará una máquina de TC para ayudar con la colocación de electrodos durante el procedimiento, particularmente cuando los electrodos se usan para tratar tumores en el cerebro.
Todo el procedimiento es muy rápido y suele tardar unos cinco minutos. La tasa de éxito de estos procedimientos es alta y es muy prometedora para futuros tratamientos en humanos. Una desventaja del uso de N-TIRE es que la electricidad entregada por los electrodos puede estimular la contracción de las células musculares, lo que podría tener consecuencias letales según la situación. Por lo tanto, se debe usar un agente paralizante al realizar el procedimiento. Los agentes paralizantes que se han utilizado en tal investigación tienen éxito; sin embargo, siempre existe algún riesgo, aunque leve, cuando se utilizan anestésicos.
H-FIRE
Se ha desarrollado una técnica más reciente llamada electroporación irreversible de alta frecuencia (H-FIRE). Esta técnica utiliza electrodos para aplicar ráfagas bipolares de electricidad a alta frecuencia, a diferencia de ráfagas unipolares de electricidad a baja frecuencia. Este tipo de procedimiento tiene el mismo éxito de ablación de tumores que N-TIRE. Sin embargo, tiene una clara ventaja, H-FIRE no causa contracción muscular en el paciente y por lo tanto no hay necesidad de un agente paralizante. Además, se ha demostrado que H-FIRE produce ablaciones más predecibles debido a la menor diferencia en las propiedades eléctricas de los tejidos a frecuencias más altas.
Entrega de fármacos y genes
La electroporación también se puede utilizar para ayudar a administrar fármacos o genes a la célula mediante la aplicación de pulsos eléctricos cortos e intensos que permeabilizan transitoriamente la membrana celular, lo que permite el transporte de moléculas que de otro modo no se transportarían a través de una membrana celular. Este procedimiento se denomina electroquimioterapia cuando las moléculas a transportar son agentes quimioterapéuticos o electrotransferencia de genes cuando la molécula a transportar es ADN. Científicos del Karolinska Institutet y la Universidad de Oxford utilizan la electroporación de exosomas para administrar ARNip, oligonucleótidos antisentido, agentes quimioterapéuticos y proteínas específicamente a las neuronas después de inyectarlas sistémicamente (en sangre). Debido a que estos exosomas pueden atravesar la barrera hematoencefálica , este protocolo podría resolver el problema de la entrega deficiente de medicamentos al sistema nervioso central y potencialmente tratar la enfermedad de Alzheimer , la enfermedad de Parkinson y el cáncer de cerebro , entre otras afecciones.
La transformación bacteriana es generalmente la forma más fácil de producir grandes cantidades de una proteína particular necesaria para fines biotecnológicos o en medicina. Dado que la electrotransferencia de genes es una técnica muy simple, rápida y altamente efectiva, primero se convirtió en un reemplazo muy conveniente para otros procedimientos de transformación.
Investigaciones recientes han demostrado que las ondas de choque podrían usarse para pretratar la membrana celular antes de la electroporación. Se ha demostrado que esta estrategia sinérgica reduce los requisitos de voltaje externo y crea poros más grandes. Además, la aplicación de ondas de choque permite que el endoscopio apunte al sitio deseado de la membrana. Este procedimiento permite controlar el tamaño del poro.
Mecanismo fisico
La electroporación permite la introducción celular de grandes moléculas altamente cargadas, como el ADN, que nunca se difundirían pasivamente a través del núcleo de la bicapa hidrófoba . Este fenómeno indica que el mecanismo es la creación de agujeros llenos de agua a escala nm en la membrana. Se obtuvieron imágenes ópticas de los electrópidos en modelos de bicapas lipídicas como bicapas de interfaz de gotitas y vesículas unilaminares gigantes, mientras que la adición de proteínas citoesqueléticas como las redes de actina a las vesículas unilaminares gigantes parece prevenir la formación de electróporos visibles. También han surgido evidencias experimentales de las redes de actina en la regulación de la permeabilidad de la membrana celular. Aunque la electroporación y la ruptura dieléctrica resultan de la aplicación de un campo eléctrico, los mecanismos involucrados son fundamentalmente diferentes. En la ruptura dieléctrica, el material de barrera se ioniza, creando una vía conductora. Por tanto, la alteración del material es de naturaleza química. Por el contrario, durante la electroporación, las moléculas de lípidos no se alteran químicamente, sino que simplemente cambian de posición, abriendo un poro que actúa como vía conductora a través de la bicapa a medida que se llena de agua.
La electroporación es un fenómeno dinámico que depende del voltaje transmembrana local en cada punto de la membrana celular. En general, se acepta que para una duración y forma de pulso determinadas, existe un umbral de voltaje transmembrana específico para la manifestación del fenómeno de electroporación (de 0,5 V a 1 V). Esto conduce a la definición de un umbral de magnitud de campo eléctrico para la electroporación (E th ). Es decir, solo las células dentro de las áreas donde E ≧ E th están electroporadas. Si se alcanza o supera un segundo umbral (E ir ), la electroporación comprometerá la viabilidad de las células, es decir , la electroporación irreversible (IRE).
La electroporación es un proceso de varios pasos con varias fases distintas. Primero, se debe aplicar un pulso eléctrico corto. Los parámetros típicos serían 300-400 mV durante <1 ms a través de la membrana (tenga en cuenta que los voltajes utilizados en los experimentos celulares son generalmente mucho mayores porque se aplican a grandes distancias a la solución a granel, por lo que el campo resultante a través de la membrana real es solo una pequeña fracción del sesgo aplicado). Tras la aplicación de este potencial, la membrana se carga como un condensador a través de la migración de iones de la solución circundante. Una vez que se alcanza el campo crítico, se produce una reordenación localizada rápida en la morfología de los lípidos. Se cree que la estructura resultante es un "pre-poro" ya que no es eléctricamente conductor pero conduce rápidamente a la creación de un poro conductor. La evidencia de la existencia de tales pre-poros proviene principalmente del "parpadeo" de los poros, lo que sugiere una transición entre estados conductores y aislantes. Se ha sugerido que estos pre-poros son defectos hidrófobos pequeños (~ 3 Å). Si esta teoría es correcta, entonces la transición a un estado conductor podría explicarse por una reordenación en el borde del poro, en el que las cabezas lipídicas se pliegan para crear una interfaz hidrófila. Finalmente, estos poros conductores pueden curar, volviendo a sellar la bicapa o expandirse, eventualmente rompiéndola. El destino resultante depende de si se superó el tamaño crítico del defecto, lo que a su vez depende del campo aplicado, la tensión mecánica local y la energía del borde bicapa.
Electroporación de genes
La aplicación de pulsos eléctricos de fuerza suficiente a la célula provoca un aumento en la diferencia de potencial transmembrana, lo que provoca la desestabilización de la membrana. La permeabilidad de la membrana celular aumenta y, de lo contrario, las moléculas no penetrantes entran en la célula. Aunque los mecanismos de la electrotransferencia de genes aún no se comprenden completamente, se demostró que la introducción de ADN solo ocurre en la parte de la membrana que mira hacia el cátodo y que se necesitan varios pasos para una transfección exitosa: migración electroforética de ADN hacia la célula, ADN inserción en la membrana, translocación a través de la membrana, migración de ADN hacia el núcleo, transferencia de ADN a través de la envoltura nuclear y finalmente expresión génica. Hay una serie de factores que pueden influir en la eficiencia de la electrotransferencia de genes, tales como: temperatura, parámetros de pulsos eléctricos, concentración de ADN, tampón de electroporación utilizado, tamaño celular y capacidad de las células para expresar genes transfectados. En la electrotransferencia de genes in vivo, la difusión del ADN a través de la matriz extracelular, las propiedades del tejido y la conductividad total del tejido también son cruciales.
Historia
En la década de 1960 se sabía que aplicando un campo eléctrico externo, se podía crear un gran potencial de membrana en los dos polos de una celda. En la década de 1970 se descubrió que cuando un potencial de membrana alcanzaba un nivel crítico, la membrana se descomponía y podía recuperarse. En la década de 1980, esta apertura se estaba utilizando para introducir varios materiales / moléculas en las células.