Pistola de genes - Gene gun
En ingeniería genética , una pistola genética o un sistema de administración de partículas biolísticas es un dispositivo que se utiliza para administrar ADN ( transgenes ), ARN o proteínas exógenos a las células. Recubriendo partículas de un metal pesado con un gen de interés y disparando estos microproyectiles en las células usando fuerza mecánica, se puede introducir una integración de la información genética deseada en las células deseadas. La técnica involucrada con tal entrega de microproyectiles de ADN a menudo se conoce como biolística .
Este dispositivo es capaz de transformar casi cualquier tipo de célula y no se limita a la transformación del núcleo; también puede transformar orgánulos, incluidos plástidos y mitocondrias .
Diseño de pistola de genes
La pistola genética era originalmente una pistola de aire Crosman modificada para disparar partículas densas de tungsteno . Fue inventado por John C Sanford , Ed Wolf y Nelson Allen en la Universidad de Cornell junto con Ted Klein de DuPont entre 1983 y 1986. El objetivo original eran las cebollas (elegidas por su gran tamaño de celda), y el dispositivo se utilizó para liberar partículas. recubierto con un gen marcador que transmitiría una señal si se produjera la inserción adecuada de la transcripción de ADN. La transformación genética se demostró tras la expresión observada del gen marcador dentro de las células de la cebolla.
Las primeras pistolas genéticas fabricadas a medida (fabricadas por Nelson Allen) usaban un cartucho de pistola de clavos calibre 22 para propulsar un cilindro de polietileno (bala) por un cañón Douglas calibre 22. Se colocó una gota del polvo de tungsteno recubierto con material genético sobre la bala y se disparó a una placa de Petri debajo. La bala se solda al disco debajo de la placa de Petri, y el material genético estalló en la muestra con un efecto de rosquilla que involucró devastación en el medio de la muestra con un anillo de buena transformación alrededor de la periferia. La pistola se conectó a una bomba de vacío y se colocó bajo vacío mientras disparaba. El diseño inicial fue puesto en producción limitada por un Rumsey-Loomis (un taller de maquinaria local entonces en Mecklenburg Road en Ithaca, Nueva York, EE. UU.).
Biolistics, Inc vendió a Dupont los derechos para fabricar y distribuir un dispositivo actualizado con mejoras que incluyen el uso de helio como propulsor no explosivo y un mecanismo de colisión de múltiples discos para minimizar el daño a los tejidos de muestra. Otros metales pesados como el oro y la plata también se utilizan para entregar material genético, siendo el oro el preferido debido a su menor citotoxicidad en comparación con los portadores de proyectiles de tungsteno.
Diseño de constructo biolístico
La transformación biolística implica la integración de un fragmento funcional de ADN, conocido como construcción de ADN, en las células diana. Una construcción genética es un casete de ADN que contiene todos los elementos reguladores necesarios para una expresión adecuada dentro del organismo objetivo. Si bien las construcciones génicas pueden variar en su diseño dependiendo del resultado deseado del procedimiento de transformación, todas las construcciones contienen típicamente una combinación de una secuencia promotora , una secuencia terminadora , el gen de interés y un gen indicador .
Promotor:
Los promotores controlan la ubicación y la magnitud de la expresión genética y funcionan como "el volante y el acelerador" de un gen. Los promotores preceden al gen de interés en la construcción de ADN y se pueden cambiar mediante el diseño de laboratorio para ajustar la expresión del transgén. El promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor es un ejemplo de un promotor de uso común que da como resultado una expresión génica constitutiva robusta dentro de las plantas.
Terminador:
Las secuencias de terminador son necesarias para la expresión génica adecuada y se colocan después de la región codificante del gen de interés dentro de la construcción de ADN. Un terminador común para la transformación biolística es el terminador NOS derivado de Agrobacterium tumefaciens . Debido a la alta frecuencia de uso de este terminador en plantas transgénicas, se han desarrollado estrategias para detectar su presencia en el suministro de alimentos para monitorear cultivos transgénicos no autorizados.
Gen reportero:
Un gen que codifica un marcador seleccionable es un elemento común dentro de las construcciones de ADN y se usa para seleccionar células transformadas adecuadamente. El marcador seleccionable elegido dependerá de la especie que se esté transformando, pero típicamente será un gen que otorgue a las células una capacidad de desintoxicación para ciertos herbicidas o antibióticos tales como kanamicina , higromicina B o glifosato .
Elementos adicionales:
Los componentes opcionales de una construcción de ADN incluyen elementos tales como secuencias crelox que permiten la eliminación controlada de la construcción del genoma diana. Dichos elementos son elegidos por el desarrollador de la construcción para realizar funciones especializadas junto con el gen principal de interés.
Solicitud
Las pistolas genéticas se utilizan principalmente con células vegetales. Sin embargo, hay mucho uso potencial en humanos y otros animales también.
Plantas
El objetivo de una pistola genética es a menudo un callo de células vegetales indiferenciadas o un grupo de embriones inmaduros que crecen en medio de gel en una placa de Petri. Una vez que las partículas de oro recubiertas de ADN se han entregado a las células, el ADN se utiliza como plantilla para la transcripción (expresión transitoria) y, a veces, se integra en un cromosoma de la planta (transformación 'estable').
Si la construcción de ADN suministrada contiene un marcador seleccionable, entonces las células transformadas de manera estable se pueden seleccionar y cultivar usando métodos de cultivo de tejidos. Por ejemplo, si la construcción de ADN suministrada contiene un gen que confiere resistencia a un antibiótico o herbicida, entonces se pueden seleccionar células transformadas de manera estable incluyendo ese antibiótico o herbicida en el medio de cultivo de tejidos.
Las células transformadas se pueden tratar con una serie de hormonas vegetales, como auxinas y giberelinas , y cada una puede dividirse y diferenciarse en las células tisulares organizadas y especializadas de una planta completa. Esta capacidad de regeneración total se llama totipotencia . La nueva planta que se originó a partir de una célula transformada con éxito puede tener nuevos rasgos que son heredables. El uso de la pistola de genes puede contrastarse con el uso de Agrobacterium tumefaciens y su plásmido Ti para insertar ADN en células vegetales. Ver transformación para diferentes métodos de transformación en diferentes especies.
Humanos y otros animales
También se han utilizado pistolas genéticas para administrar vacunas de ADN .
La administración de plásmidos a neuronas de rata mediante el uso de una pistola de genes, específicamente neuronas DRG, también se utiliza como precursor farmacológico en el estudio de los efectos de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer .
La pistola de genes se ha convertido en una herramienta común para marcar subconjuntos de células en tejido cultivado. Además de poder transfectar células con plásmidos de ADN que codifican proteínas fluorescentes, la pistola de genes se puede adaptar para administrar una amplia variedad de tintes vitales a las células.
El bombardeo con pistola genética también se ha utilizado para transformar Caenorhabditis elegans , como alternativa a la microinyección .
Ventajas
La biolística ha demostrado ser un método versátil de modificación genética y generalmente se prefiere diseñar cultivos resistentes a la transformación, como los cereales . En particular, el maíz Bt es un producto de la biolística. La transformación de plástidos también ha tenido un gran éxito con el bombardeo de partículas en comparación con otras técnicas actuales, como la transformación mediada por Agrobacterium , que tienen dificultades para dirigir el vector hacia el cloroplasto y expresarse de manera estable en él. Además, no hay informes de que un cloroplasto silencie un transgén insertado con una pistola de genes. Además, con solo un disparo de una pistola genética, un técnico experto puede generar dos organismos transformados. Esta tecnología incluso ha permitido la modificación de tejidos específicos in situ , aunque es probable que esto dañe un gran número de células y transforme solo algunas , en lugar de todas, las células del tejido.
Limitaciones
Biolistics introduce ADN de forma aleatoria en las células diana. Por lo tanto, el ADN puede transformarse en cualquier genoma que esté presente en la célula, ya sea nuclear, mitocondrial, plásmido o cualquier otro, en cualquier combinación, aunque el diseño de construcción adecuado puede mitigar esto. La entrega e integración de múltiples moldes de la construcción de ADN es una posibilidad distinta, lo que resulta en niveles de expresión y número de copias variables potenciales del gen insertado. Esto se debe a la capacidad de las construcciones para dar y tomar material genético de otras construcciones, lo que hace que algunas no porten transgén y otras que porten múltiples copias; el número de copias insertadas depende tanto de cuántas copias del transgén tenga una construcción insertada como de cuántas se insertaron. Además, debido a que las construcciones eucariotas se basan en la recombinación ilegítima, un proceso mediante el cual el transgén se integra en el genoma sin secuencias genéticas similares, y no en la recombinación homóloga , no pueden dirigirse a ubicaciones específicas dentro del genoma, a menos que el transgén se administre conjuntamente con reactivos de edición del genoma .
Referencias
Otras lecturas
- O'Brien, J; Holt, M; Whiteside, G; Lummis, SC; Hastings, MH (2001). "Modificaciones al Gene Gun de mano: mejoras para la transfección biolística in vitro de tejido neuronal organotípico". Revista de métodos de neurociencia . 112 (1): 57–64. doi : 10.1016 / S0165-0270 (01) 00457-5 . PMID 11640958 . S2CID 30561105 .
enlaces externos
- John O'Brien presenta ... Gene Gun Barrels para obtener más información sobre biolística