Meganucleasa - Meganuclease

Las meganucleasas son endodeoxyribonucleases caracterizadas por un sitio de reconocimiento de gran tamaño (secuencias de ADN de doble cadena-de 12 a 40 pares de bases); como resultado, este sitio generalmente ocurre solo una vez en cualquier genoma dado . Por ejemplo, la secuencia de 18 pares de bases reconocida por la meganucleasa I-SceI requeriría en promedio un genoma veinte veces el tamaño del genoma humano para ser encontrado una vez por casualidad (aunque las secuencias con un solo desajuste ocurren aproximadamente tres veces por humano). genoma de tamaño). Por lo tanto, se considera que las meganucleasas son las enzimas de restricción naturales más específicas .

Entre las meganucleasas, la familia LAGLIDADG de endonucleasas autodirigidas se ha convertido en una herramienta valiosa para el estudio de los genomas y la ingeniería del genoma durante los últimos quince años. Las meganucleasas son " tijeras de ADN molecular " que se pueden usar para reemplazar, eliminar o modificar secuencias de una manera altamente dirigida. Modificando su secuencia de reconocimiento mediante ingeniería de proteínas, se puede cambiar la secuencia objetivo. Las meganucleasas se utilizan para modificar todos los tipos de genomas, ya sean bacterianos, vegetales o animales. Abren amplias avenidas para la innovación, especialmente en el campo de la salud humana, por ejemplo, la eliminación de material genético viral o la "reparación" de genes dañados mediante terapia génica.

Dos familias principales

Las meganucleasas se encuentran en una gran cantidad de organismos: arqueas o arqueobacterias, bacterias, fagos , hongos, levaduras , algas y algunas plantas. Pueden expresarse en diferentes compartimentos de la célula: el núcleo , las mitocondrias o los cloroplastos . Se han identificado varios cientos de estas enzimas .

Las meganucleasas están representadas principalmente por dos familias de enzimas principales conocidas colectivamente como endonucleasas autodirigidas: endonucleasas intrónicas y endonucleasas inteína.

En la naturaleza, estas proteínas están codificadas por elementos genéticos móviles, intrones o inteínas . Los intrones se propagan al intervenir en una ubicación precisa en el ADN, en donde la expresión de la meganucleasa produce una ruptura en la intrón- o inteína libre complementario alelo . Para las inteínas y los intrones del grupo I, esta ruptura conduce a la duplicación del intrón o inteína en el sitio de corte mediante la reparación de recombinación homóloga para las rupturas del ADN bicatenario.

Sabemos relativamente poco sobre el propósito real de las meganucleasas. Se piensa ampliamente que el material genético que codifica las meganucleasas funciona como un elemento parásito que utiliza los mecanismos de reparación de las células de ADN de doble hebra en su propio beneficio como medio de multiplicarse y propagarse, sin dañar el material genético de su huésped.

Endonucleasas autóctonas de la familia LAGLIDADG

Hay cinco familias o clases de endonucleasas autodirigidas. La más extendida y conocida es la familia LAGLIDADG . Las endonucleasas de la familia LAGLIDADG se encuentran principalmente en las mitocondrias y cloroplastos de organismos unicelulares eucariotas.

El nombre de esta familia corresponde a una secuencia (o motivo) de aminoácidos que se encuentra, más o menos conservada, en todas las proteínas de esta familia. Estas pequeñas proteínas también son conocidas por sus estructuras tridimensionales compactas y empaquetadas.

Las endonucleasas mejor caracterizadas que se utilizan más ampliamente en la investigación y la ingeniería del genoma incluyen I-SceI (descubierta en las mitocondrias de la levadura de panadería Saccharomyces cerevisiae ), I-CreI (de los cloroplastos del alga verde Chlamydomonas reinhardtii ) e I-DmoI (de la arqueobacteria Desulfurococcus mobilis ).

Las endonucleasas de LAGLIDADG más conocidas son los homodímeros (por ejemplo, I-CreI, compuesto por dos copias del mismo dominio de proteína) o monómeros simétricos internamente (I-SceI). El sitio de unión del ADN, que contiene el dominio catalítico , se compone de dos partes a cada lado del punto de corte. Los sitios de semi-unión pueden ser extremadamente similares y unirse a una secuencia de ADN palindrómica o semipalindrómica (I-CreI), o pueden ser no palindrómicas (I-SceI).

Como herramientas para la ingeniería del genoma

La alta especificidad de las meganucleasas les da un alto grado de precisión y una toxicidad celular mucho menor que otras enzimas de restricción naturales. Las meganucleasas se identificaron en la década de 1990 y el trabajo posterior ha demostrado que son herramientas particularmente prometedoras para la ingeniería del genoma y la edición de genes , ya que pueden inducir eficientemente la recombinación homóloga, generar mutaciones y alterar los marcos de lectura.

Sin embargo, las recombinaciones genéticas inducidas por meganucleasas que podían realizarse estaban limitadas por el repertorio de meganucleasas disponibles. A pesar de la existencia de cientos de meganucleasas en la naturaleza y del hecho de que cada una es capaz de tolerar variaciones menores en su sitio de reconocimiento, la probabilidad de encontrar una meganucleasa capaz de cortar un gen determinado en la ubicación deseada es extremadamente pequeña. Varios grupos centraron su atención en la ingeniería de nuevas meganucleasas que apunten a los sitios de reconocimiento deseados.

Las investigaciones y aplicaciones más avanzadas se refieren a endonucleasas autóctonas de la familia LAGLIDADG.

Para crear meganucleasas a medida, se han adoptado dos enfoques principales:

  • Modificar la especificidad de las meganucleasas existentes introduciendo un pequeño número de variaciones en la secuencia de aminoácidos y luego seleccionando las proteínas funcionales en las variaciones del sitio de reconocimiento natural.
  • Una opción más radical ha sido explotar una propiedad que juega un papel importante en el alto grado de diversificación natural de las meganucleasas: la posibilidad de asociar o fusionar dominios proteicos de diferentes enzimas . Esta opción permite desarrollar meganucleasas quiméricas con un nuevo sitio de reconocimiento compuesto por un medio sitio de meganucleasa A y un medio sitio de proteína B. Al fusionar los dominios proteicos de I-DmoI e I-CreI, se han obtenido dos meganucleasas quiméricas ha sido creado utilizando este método: E-Drel y DmoCre.

Estos dos enfoques se pueden combinar para aumentar la posibilidad de crear nuevas enzimas, mientras se mantiene un alto grado de eficacia y especificidad. Los científicos de Cellectis han estado trabajando en la edición de genes desde 1999 y han desarrollado una colección de más de 20.000 dominios de proteínas de la meganucleasa I-CreI homodimérica, así como de otros andamios de meganucleasas. Se pueden combinar para formar heterodímeros quiméricos funcionales hechos a medida para laboratorios de investigación y para fines industriales.

Precision Biosciences, otra empresa de biotecnología, ha desarrollado un proceso de diseño totalmente racional llamado Editor de nucleasa dirigida (DNE) que es capaz de crear meganucleasas diseñadas que se dirigen y modifican una ubicación definida por el usuario en un genoma. En 2012, los investigadores de Bayer CropScience utilizaron DNE para incorporar una secuencia genética en el ADN de las plantas de algodón, dirigiéndola con precisión a un sitio predeterminado.

Aplicaciones adicionales

Un avance reciente en el uso de meganucleasas para la ingeniería del genoma es la incorporación del dominio de unión al ADN de efectores de tipo activador de la transcripción (TAL) en nucleasas híbridas. Estos "megaTAL" combinan la facilidad de ingeniería y la alta especificidad de unión al ADN de un efector de TAL con la alta eficiencia de escisión de las meganucleasas. Además, las meganucleasas se han fusionado con enzimas de procesamiento de extremos de ADN para promover la unión de extremos no homólogos propensa a errores y para aumentar la frecuencia de eventos mutagénicos en un locus dado.

Probabilidades

Como se indica en el párrafo inicial, una meganucleasa con una secuencia de 18 pares de bases requeriría en promedio un genoma veinte veces mayor que el del genoma humano para ser encontrado una vez por casualidad; el cálculo es 4 18 / 3x10 9 = 22,9. Sin embargo, las secuencias muy similares son mucho más comunes, y la frecuencia aumenta rápidamente a medida que se permiten más desajustes.

Por ejemplo, una secuencia que es idéntica en todos menos en un par de bases se produciría por casualidad una vez cada 4 17 / 18x3x10 9 = 0,32 equivalentes de genoma humano en promedio, o tres veces por genoma humano. Una secuencia que es idéntica en todos los pares de bases excepto en dos ocurriría en promedio por casualidad una vez cada 4 16 / (18C2) x3x10 9 = 0,0094 equivalentes de genoma humano, o 107 veces por genoma humano.

Esto es importante porque las enzimas no tienen una discriminación perfecta; una nucleasa todavía tendrá alguna probabilidad de actuar incluso si la secuencia no coincide perfectamente. Por lo tanto, la actividad de la nucleasa en una secuencia con un desajuste es menor que en el caso de no emparejamiento, y la actividad es incluso menor para dos desajustes, pero todavía no es cero. La exclusión de estas secuencias, que son muy similares pero no idénticas, sigue siendo un problema importante que debe superarse en la ingeniería del genoma.

Otras Consideraciones

La metilación del ADN y la estructura de la cromatina afectan la eficacia de la digestión con meganucleasas. Por tanto, es necesaria una consideración exhaustiva del contexto genético y epigenético de una secuencia diana para la aplicación práctica de estas enzimas.

En diciembre de 2014, la USPTO emitió la patente 8,921,332 que cubre la edición del genoma basada en meganucleasas in vitro. Esta patente fue licenciada exclusivamente a Cellectis.

Ver también

Referencias

enlaces externos