Uracil-DNA glicosilasa - Uracil-DNA glycosylase
Uracil-ADN glicosilasa , también conocida como UNG o UDG . Su función más importante es prevenir la mutagénesis eliminando el uracilo de las moléculas de ADN mediante la escisión del enlace N-glicosídico e iniciando la vía de reparación por escisión de base (BER).
Función
El gen humano codifica una de varias glicosilasas de uracilo-ADN. El uso de promotores alternativos y el empalme de este gen conduce a dos isoformas diferentes: la UNG1 mitocondrial y la UNG2 nuclear. Una función importante de las glicosilasas de uracilo-ADN es prevenir la mutagénesis eliminando el uracilo de las moléculas de ADN mediante la escisión del enlace N-glicosídico e iniciando la vía de reparación por escisión de base (BER). Las bases de uracilo se producen por desaminación de citosina o incorporación incorrecta de residuos dUMP . Después de que ocurre una mutación, la amenaza mutagénica del uracilo se propaga a través de cualquier paso posterior de replicación del ADN . Una vez descomprimidos, los pares de guanina y uracilo que no coinciden se separan y la ADN polimerasa inserta bases complementarias para formar un par de guanina-citosina (GC) en una hebra hija y un par de adenina- uracilo (AU) en la otra. La mitad de todo el ADN de la progenie derivado de la plantilla mutada hereda un cambio de GC a AU en el sitio de la mutación. UDG escinde el uracilo en los pares AU y GU para evitar la propagación del desajuste de bases a los procesos de transcripción y traducción posteriores. Con alta eficiencia y especificidad, esta glicosilasa repara de 100 a 500 bases dañadas diariamente en la célula humana. Las células humanas expresan de cinco a seis tipos de glicosilasas de ADN , todas las cuales comparten un mecanismo común de eversión y escisión de bases como medio de reparación del ADN.
Estructura
UDG está hecho de una hoja β paralela de cuatro hebras rodeada por ocho hélices α . El sitio activo comprende cinco motivos altamente conservados que catalizan colectivamente la escisión del enlace glicosídico :
- Bucle de activación de agua: 63-QDPYH-67
- Pro -bucle rico: 165-PPPPS-169
- Motivo de unión de uracilo: 199-GVLLLN-204
- Gly - Ser lazo: 246-GS-247
- Bucle de intercalación de surcos menores : 268-HPSPLS-273
Mecanismo
La escisión del enlace glucosídico sigue un mecanismo de "pellizcar-empujar-tirar" utilizando los cinco motivos conservados.
Pellizco : UDG escanea el ADN en busca de uracilo al unirse de manera inespecífica a la hebra y crear un nudo en la columna vertebral, lo que coloca la base seleccionada para la detección. Los bucles Pro-rich y Gly-Ser forman contactos polares con los fosfatos 3 'y 5' que flanquean la base examinada. Esta compresión de la columna vertebral del ADN , o "pellizco", permite un contacto cercano entre UDG y la base de interés.
Empujar : para evaluar completamente la identidad de los nucleótidos, el bucle de intercalación penetra, o empuja, en el surco menor del ADN e induce un cambio conformacional para voltear el nucleótido fuera de la hélice. La compresión de la columna vertebral favorece la eversión del nucleótido ahora extrahelical, que está posicionado para ser reconocido por el motivo de unión a uracilo. El acoplamiento de intercalación y eversión ayuda a compensar la interrupción de las interacciones favorables de apilamiento de bases dentro de la hélice de ADN. Leu 272 llena el vacío dejado por el nucleótido invertido para crear interacciones de dispersión con bases vecinas y restaurar la estabilidad de apilamiento.
Tirar : ahora accesible al sitio activo, el nucleótido interactúa con el motivo de unión de uracilo. La forma del sitio activo complementa la estructura del uracilo evertido, lo que permite una alta especificidad del sustrato. Las purinas son demasiado grandes para caber en el sitio activo, mientras que las interacciones desfavorables con otras pirimidinas desalientan la unión de sustratos alternativos. La cadena lateral de Tyr 147 interfiere estéricamente con el grupo metilo timina C5 , mientras que un enlace de hidrógeno específico entre el uracilo O2 carbonilo y Gln 144 discrimina contra un sustrato de citosina, que carece del carbonilo necesario. Una vez que se reconoce el uracilo, la escisión del enlace glicosídico procede de acuerdo con el mecanismo a continuación.
La posición de los residuos que activan el nucleófilo del agua y protonan el grupo saliente del uracilo son ampliamente debatidos, aunque el mecanismo más seguido emplea el circuito de activación del agua detallado en la estructura de la enzima. Independientemente de la posición, las identidades de los residuos de ácido aspártico e histidina son consistentes en todos los estudios catalíticos.
Uso de laboratorio
Uracil N -glycosylase (UNG) es una enzima utilizada en un método poderoso para eliminar el arrastre reacción en cadena de la polimerasa productos (PCR) en tiempo real PCR. Este método modifica los productos de PCR de manera que en una nueva reacción, cualquier producto residual de amplificaciones de PCR anteriores será digerido y se evitará su amplificación, pero las verdaderas plantillas de ADN no se verán afectadas. La PCR sintetiza abundantes productos de amplificación en cada ronda, pero la contaminación de las siguientes rondas de PCR con trazas de estos productos, denominada contaminación de arrastre, produce resultados falsos positivos. El arrastre de contaminación de alguna PCR anterior puede ser un problema importante, debido tanto a la abundancia de productos de PCR como a la estructura ideal del material contaminante para la reamplificación. Sin embargo, la contaminación de arrastre se puede controlar mediante los siguientes dos pasos: (i) incorporando dUTP en todos los productos de PCR (sustituyendo dUTP por dTTP, o incorporando uracilo durante la síntesis de cebadores; y (ii) tratando todas las reacciones de inicio posteriores completamente preensambladas con uracilo ADN glicosilasa (UDG), seguido de la inactivación térmica de UDG. UDG escinde la base de uracilo de la cadena principal del fosfodiéster del ADN que contiene uracilo, pero no tiene ningún efecto sobre el ADN natural (es decir, que contiene timina). Los sitios apirimidínicos resultantes bloquean replicación por ADN polimerasas, y son muy lábiles a la hidrólisis ácido / base. Debido a que la UDG no reacciona con dTTP y también se inactiva por desnaturalización por calor antes de la PCR real, la contaminación remanente de las PCR se puede controlar de manera efectiva si los contaminantes contienen uracilos en lugar de timinas.
Uracil N -glycosylase también se utilizó en un estudio para detectar pruebas de la actividad metabólica continua de bajo nivel y la reparación del ADN en las bacterias antiguas. La supervivencia a largo plazo de las bacterias puede ocurrir a través de la formación de endosporas (en la que la bacteria entra en latencia total, sin que tenga lugar ninguna actividad metabólica y, por lo tanto, sin reparación del ADN), o bien mediante la reducción de la actividad metabólica a un nivel muy bajo. velocidad, apenas suficiente para llevar a cabo la reparación continua del ADN y prevenir el agotamiento de otras moléculas inestables (como el ATP ), en las que el microbio es capaz de reparar el daño a su ADN pero también continúa consumiendo nutrientes lentamente. Las secuencias de ADN de bacterias en permafrost se amplificaron mediante PCR. Una serie de corridas amplificó las secuencias de ADN tal cual (para detectar todo el ADN bacteriano vivo en las muestras), mientras que la otra serie buscó específicamente el ADN que se había estado reparando en curso; para ello, el ADN se trató con UNG para eliminar los uracilos. Esto impidió la amplificación del ADN no reparado de dos maneras: en primer lugar, los sitios abásicos generados por la eliminación de uracilos impidieron que la ADN polimerasa utilizada en la PCR pasara más allá del sitio del daño, mientras que estos sitios abásicos también debilitaron directamente el ADN y lo hicieron más probable. fragmentarse al calentarse. De esta manera, los investigadores pudieron mostrar evidencia de reparación del ADN en curso en bacterias grampositivas con alto contenido de GC hasta 600.000 años de edad.
La uracil N glicosilasa también se ha utilizado en un método para la clonación de fragmentos de ADN amplificados por PCR. En este método, los cebadores utilizados en la PCR se sintetizan con residuos de uracilo en lugar de timina. Cuando estos cebadores se incorporan en fragmentos amplificados por PCR, la secuencia del cebador se vuelve susceptible a la digestión con uracilo N glicosilasa y produce extremos salientes 3 'que se pueden hibridar con un ADN de vector preparado apropiadamente. Las moléculas quiméricas resultantes se pueden transformar en células competentes con alta eficacia, sin necesidad de ligación in vitro.
Interacciones
Se ha demostrado que la uracil-ADN glicosilasa interactúa con RPA2 .
