Abrazadera de parche - Patch clamp
La técnica de pinza de parche es una técnica de laboratorio en electrofisiología que se utiliza para estudiar las corrientes iónicas en células vivas aisladas individuales , secciones de tejido o parches de membrana celular. La técnica es especialmente útil en el estudio de células excitables como neuronas , cardiomiocitos , fibras musculares y células beta pancreáticas , y también se puede aplicar al estudio de canales iónicos bacterianos en esferoplastos gigantes especialmente preparados .
La sujeción por parche se puede realizar mediante la técnica de sujeción por tensión . En este caso, el experimentador controla el voltaje a través de la membrana celular y se registran las corrientes resultantes. Como alternativa, se puede utilizar la técnica de pinza de corriente . En este caso, el experimentador controla la corriente que pasa a través de la membrana y se registran los cambios de voltaje resultantes, generalmente en forma de potenciales de acción .
Erwin Neher y Bert Sakmann desarrollaron la abrazadera de parche a fines de la década de 1970 y principios de la de 1980. Este descubrimiento hizo posible registrar las corrientes de moléculas de un solo canal iónico por primera vez, lo que mejoró la comprensión de la participación de los canales en los procesos celulares fundamentales, como los potenciales de acción y la actividad nerviosa. Neher y Sakmann recibieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1991 por este trabajo.
Técnica básica
Configuración
Durante una grabación de pinza de parche, un tubo de vidrio hueco conocido como micropipeta o pipeta de parche lleno de una solución de electrolito y un electrodo de grabación conectado a un amplificador se ponen en contacto con la membrana de una celda aislada . Otro electrodo se coloca en un baño que rodea la celda o tejido como electrodo de tierra de referencia . Puede formarse un circuito eléctrico entre el electrodo de registro y de referencia con la celda de interés en el medio.
La solución que llena la pipeta de parche puede coincidir con la composición iónica de la solución del baño, como en el caso de la grabación de células adjuntas, o coincidir con el citoplasma , para la grabación de células completas. La solución en la solución del baño puede coincidir con la solución extracelular fisiológica, el citoplasma, o ser completamente no fisiológica, dependiendo del experimento a realizar. El investigador también puede cambiar el contenido de la solución de baño (o menos comúnmente la solución de pipeta) agregando iones o fármacos para estudiar los canales iónicos en diferentes condiciones.
Dependiendo de lo que el investigador esté tratando de medir, el diámetro de la punta de la pipeta utilizada puede variar, pero generalmente está en el rango del micrómetro . Este pequeño tamaño se usa para encerrar un área de superficie de membrana celular o "parche" que a menudo contiene solo una o unas pocas moléculas de canal iónico. Este tipo de electrodo es distinto del "microelectrodo afilado" que se usa para perforar las células en los registros intracelulares tradicionales , ya que está sellado sobre la superficie de la membrana celular, en lugar de insertarse a través de ella.
En algunos experimentos, la punta de la micropipeta se calienta en una microforge para producir una superficie lisa que ayuda a formar un sello de alta resistencia con la membrana celular. Para obtener este sello de alta resistencia, la micropipeta se presiona contra una membrana celular y se aplica succión. Una porción de la membrana celular se succiona en la pipeta, creando un área de membrana en forma de omega que, si se forma correctamente, crea una resistencia en el rango de 10 a 100 gigaohmios , llamada "sello de gigaohmios" o "gigaseal". La alta resistencia de este sello permite aislar electrónicamente las corrientes medidas a través del parche de membrana con poco ruido competitivo , además de proporcionar cierta estabilidad mecánica a la grabación.
Grabación
Muchos amplificadores de pinza de conexión no utilizan circuitos de pinza de voltaje real , sino que son amplificadores diferenciales que utilizan el electrodo de baño para establecer el nivel de corriente cero (tierra). Esto permite que un investigador mantenga constante el voltaje mientras observa cambios en la corriente . Para realizar estas grabaciones, la pipeta de parche se compara con el electrodo de tierra. Luego se inyecta corriente en el sistema para mantener un voltaje fijo constante. La corriente que se necesita para sujetar el voltaje es de signo opuesto e igual en magnitud a la corriente a través de la membrana.
Alternativamente, la celda se puede sujetar a la corriente en el modo de celda completa, manteniendo la corriente constante mientras se observan los cambios en el voltaje de la membrana .
Variaciones
Se pueden aplicar varias variaciones de la técnica básica, dependiendo de lo que quiera estudiar el investigador. Las técnicas de adentro hacia afuera y de afuera hacia afuera se denominan técnicas de "parche extirpado", porque el parche se extirpa (retira) del cuerpo principal de la célula. Para estudiar el comportamiento de los canales iónicos individuales en la sección de la membrana unida al electrodo, se utilizan técnicas de parche de unión celular y ambas extirpadas.
El parche de célula completa y el parche perforado permiten al investigador estudiar el comportamiento eléctrico de toda la célula, en lugar de las corrientes de un solo canal. El parche de celda completa, que permite el acceso eléctrico de baja resistencia al interior de una celda, ahora ha reemplazado en gran medida las técnicas de grabación de microelectrodos de alta resistencia para registrar corrientes a través de toda la membrana celular.
Parche adjunto a la celda
Para este método, la pipeta se sella sobre la membrana celular para obtener un gigaseal (un sello con resistencia eléctrica del orden de un gigaohmio), mientras se asegura que la membrana celular permanezca intacta. Esto permite el registro de corrientes a través de uno o unos pocos canales iónicos contenidos en el parche de membrana capturado por la pipeta. Al adherirse solo al exterior de la membrana celular, hay muy poca alteración de la estructura celular. Además, al no alterar el interior de la célula, cualquier mecanismo intracelular que influya normalmente en el canal aún podrá funcionar como lo haría fisiológicamente. Con este método también es relativamente fácil obtener la configuración correcta y, una vez obtenida, es bastante estable.
Para los canales iónicos activados por ligando o los canales que están modulados por receptores metabotrópicos , el neurotransmisor o fármaco que se está estudiando generalmente se incluye en la solución de la pipeta, donde puede interactuar con lo que solía ser la superficie externa de la membrana. La actividad del canal resultante puede atribuirse al fármaco que se está utilizando, aunque normalmente no es posible cambiar la concentración del fármaco dentro de la pipeta. Por tanto, la técnica se limita a un punto en una curva de respuesta a la dosis por parche. Por lo tanto, la respuesta a la dosis se logra utilizando varias células y parches. Sin embargo, los canales iónicos activados por voltaje se pueden sujetar sucesivamente a diferentes potenciales de membrana en un solo parche. Esto da como resultado la activación del canal en función del voltaje, y se puede establecer una curva IV (corriente-voltaje) completa en un solo parche. Otro posible inconveniente de esta técnica es que, al igual que las vías intracelulares de la célula no se alteran, tampoco pueden modificarse directamente.
Parche de adentro hacia afuera
En el método de adentro hacia afuera, se une un parche de la membrana a la pipeta de parche, se separa del resto de la célula, y la superficie citosólica de la membrana se expone al medio externo o baño. Una ventaja de este método es que el experimentador tiene acceso a la superficie intracelular de la membrana a través del baño y puede cambiar la composición química a la que está expuesta la superficie interior de la membrana. Esto es útil cuando un experimentador desea manipular el entorno en la superficie intracelular de canales iónicos individuales. Por ejemplo, los canales que son activados por ligandos intracelulares pueden estudiarse luego a través de un rango de concentraciones de ligando.
Para lograr la configuración de adentro hacia afuera, la pipeta se une a la membrana celular como en el modo de unión celular, formando una gigaseal, y luego se retrae para romper un parche de membrana del resto de la célula. La extracción de un parche de membrana a menudo da como resultado inicialmente la formación de una vesícula de membrana en la punta de la pipeta, porque los extremos de la membrana del parche se fusionan rápidamente después de la escisión. La cara exterior de la vesícula debe abrirse para entrar en el modo de adentro hacia afuera; esto se puede hacer pasando brevemente la membrana a través de la interfase solución de baño / aire, exponiéndola a una solución baja en Ca 2+ o haciendo contacto momentáneo con una gota de parafina o un trozo de polímero de silicona curado .
Registro de células completas o parche de células completas
Las grabaciones de células completas implican el registro de corrientes a través de múltiples canales simultáneamente, sobre una gran región de la membrana celular. El electrodo se deja en su lugar en la celda, como en los registros adjuntos a la celda, pero se aplica más succión para romper el parche de membrana, proporcionando así acceso desde el interior de la pipeta al espacio intracelular de la celda. Esto proporciona un medio para administrar y estudiar cómo los tratamientos (por ejemplo, medicamentos) pueden afectar a las células en tiempo real. Una vez que la pipeta está unida a la membrana celular, existen dos métodos para romper el parche. La primera es aplicando más succión. La cantidad y duración de esta succión depende del tipo de celda y del tamaño de la pipeta. El otro método requiere que se envíe un gran pulso de corriente a través de la pipeta. La cantidad de corriente que se aplica y la duración del pulso también dependen del tipo de celda. Para algunos tipos de células, es conveniente aplicar ambos métodos simultáneamente para romper el parche.
La ventaja del registro de pinza de parche de celda completa sobre el registro de técnica de electrodo afilado es que la abertura más grande en la punta del electrodo de pinza de parche proporciona una resistencia menor y, por lo tanto, un mejor acceso eléctrico al interior de la celda. Una desventaja de esta técnica es que debido a que el volumen del electrodo es mayor que el volumen de la celda, el contenido soluble del interior de la celda será reemplazado lentamente por el contenido del electrodo. Esto se conoce como el electrodo que "dializa" el contenido de la celda. Después de un tiempo, se alterarán todas las propiedades de la célula que dependan del contenido intracelular soluble. La solución de pipeta utilizada generalmente se aproxima al ambiente de alto contenido de potasio del interior de la celda para minimizar cualquier cambio que esto pueda causar. A menudo hay un período al comienzo de un registro de célula completa en el que se pueden tomar medidas antes de que la célula se haya dializado.
Parche de afuera hacia afuera
El nombre "de afuera hacia afuera" enfatiza tanto la complementariedad de esta técnica con la técnica de adentro hacia afuera, como el hecho de que coloca la superficie externa en lugar de la intracelular de la membrana celular en el exterior del parche de membrana, en relación con el electrodo del parche. .
La formación de un parche de afuera hacia afuera comienza con una configuración de grabación de celda completa. Después de que se formó la configuración de célula completa, el electrodo se retira lentamente de la célula, lo que permite una bombilla de membrana para ampolla de filtración hacia fuera de la célula. Cuando el electrodo se aleja lo suficiente, esta ampolla se desprenderá de la celda y se volverá a formar como una membrana convexa en el extremo del electrodo (como una bola abierta en la punta del electrodo), con el exterior original de la membrana mirando hacia afuera de la electrodo. Como muestra la imagen de la derecha, esto significa que el líquido dentro de la pipeta estará simulando el líquido intracelular, mientras que un investigador es libre de mover la pipeta y la ampolla con sus canales a otro baño de solución. Si bien pueden existir múltiples canales en una ampolla de membrana, las grabaciones de un solo canal también son posibles en esta conformación si la ampolla de membrana desprendida es pequeña y solo contiene un canal.
El parcheo de afuera hacia afuera le da al experimentador la oportunidad de examinar las propiedades de un canal de iones cuando se aísla de la célula y se expone sucesivamente a diferentes soluciones en la superficie extracelular de la membrana. El experimentador puede perfundir el mismo parche con una variedad de soluciones en un período de tiempo relativamente corto, y si el canal es activado por un neurotransmisor o fármaco de la cara extracelular, entonces se puede obtener una curva dosis-respuesta . Esta capacidad de medir la corriente a través de exactamente la misma pieza de membrana en diferentes soluciones es la ventaja distintiva del parche de afuera hacia afuera en relación con el método de unión celular. Por otro lado, es más difícil de lograr. El proceso de formación más largo implica más pasos que podrían fallar y da como resultado una menor frecuencia de parches utilizables.
Parche perforado
Esta variación del método de pinza de parche es muy similar a la configuración de celda completa. La principal diferencia radica en el hecho de que cuando el experimentador forma el sello de gigaohmios, no se usa succión para romper la membrana del parche. En cambio, la solución del electrodo contiene pequeñas cantidades de un agente antimicótico o antibiótico , como anfotericina-B , nistatina o gramicidina , que se difunde en el parche de la membrana y forma pequeños poros en la membrana, proporcionando acceso eléctrico al interior de la célula. Al comparar los métodos de parche de células enteras y perforado, se puede pensar en el parche de células enteras como una puerta abierta, en la que hay un intercambio completo entre las moléculas de la solución de pipeta y el citoplasma. El parche perforado se puede comparar con una puerta de malla que solo permite el intercambio de ciertas moléculas de la solución de la pipeta al citoplasma de la célula.
Las ventajas del método del parche perforado, en relación con los registros de células completas, incluyen las propiedades de los poros del antibiótico, que permiten el equilibrio solo de pequeños iones monovalentes entre la pipeta del parche y el citosol, pero no de moléculas más grandes que no pueden penetrar a través de los poros. Esta propiedad mantiene niveles endógenos de iones divalentes como Ca 2+ y moléculas de señalización como cAMP . En consecuencia, uno puede tener grabaciones de la célula completa, como en el pinzamiento de parche de célula completa, mientras se retienen la mayoría de los mecanismos de señalización intracelular, como en las grabaciones adjuntas a la célula. Como resultado, hay una reducción de la corriente actual y las grabaciones de parches perforados estables pueden durar más de una hora. Las desventajas incluyen una mayor resistencia de acceso, en relación con la celda completa, debido a la membrana parcial que ocupa la punta del electrodo. Esto puede disminuir la resolución actual y aumentar el ruido de grabación. También puede tomar una cantidad significativa de tiempo para que el antibiótico perfore la membrana (aproximadamente 15 minutos para la anfotericina-B, e incluso más para la gramicidina y la nistatina). La membrana debajo de la punta del electrodo se debilita por las perforaciones formadas por el antibiótico y puede romperse. Si el parche se rompe, la grabación se realiza en modo de célula completa, con el antibiótico contaminando el interior de la célula.
Parche suelto
una abrazadera de parche suelta es diferente de las otras técnicas discutidas aquí en que emplea un sello suelto (baja resistencia eléctrica) en lugar del gigaseal apretado usado en la técnica convencional. Esta técnica se utilizó ya en el año 1961, como se describe en un artículo de Strickholm sobre la impedancia de la superficie de una célula muscular, pero recibió poca atención hasta que Almers, Stanfield y Stühmer la mencionaron nuevamente y le dieron un nombre en 1982. después de que el patch clamp se estableciera como una herramienta importante de electrofisiología.
Para lograr un parche suelto en la membrana de una celda, la pipeta se mueve lentamente hacia la celda, hasta que la resistencia eléctrica del contacto entre la celda y la pipeta aumente a unas pocas veces mayor resistencia que la del electrodo solo. Cuanto más se acerque la pipeta a la membrana, mayor será la resistencia de la punta de la pipeta, pero si se forma un sello demasiado cerca, podría resultar difícil retirar la pipeta sin dañar la celda. Para la técnica del parche suelto, la pipeta no se acerca lo suficiente a la membrana para formar una conexión gigaseal o permanente, ni para perforar la membrana celular. La membrana celular permanece intacta y la falta de un sello hermético crea un pequeño espacio a través del cual los iones pueden pasar fuera de la célula sin entrar en la pipeta.
Una ventaja significativa del sello suelto es que la pipeta que se usa se puede quitar repetidamente de la membrana después de la grabación, y la membrana permanecerá intacta. Esto permite mediciones repetidas en una variedad de ubicaciones en la misma celda sin destruir la integridad de la membrana. Esta flexibilidad ha sido especialmente útil para los investigadores para estudiar la contracción de las células musculares en condiciones fisiológicas reales, obteniendo grabaciones rápidamente y sin recurrir a medidas drásticas para evitar que las fibras musculares se contraigan. Una desventaja importante es que la resistencia entre la pipeta y la membrana se reduce en gran medida, lo que permite que la corriente se filtre a través del sello y reduzca significativamente la resolución de pequeñas corrientes. Sin embargo, esta fuga puede corregirse parcialmente, lo que ofrece la oportunidad de comparar y contrastar grabaciones realizadas desde diferentes áreas de la celda de interés. Dado esto, se ha estimado que la técnica del parche suelto puede resolver corrientes menores a 1 mA / cm 2 .
Sujeción automática de parche
Se han desarrollado sistemas de abrazadera de parche automatizados para recopilar grandes cantidades de datos de forma económica en un período de tiempo más corto. Dichos sistemas incluyen típicamente un dispositivo de microfluidos de un solo uso , ya sea un chip moldeado por inyección o de polidimetilsiloxano (PDMS), para capturar una celda o celdas, y un electrodo integrado.
En una forma de tal sistema automatizado, se usa una diferencia de presión para forzar a las células que se están estudiando a ser arrastradas hacia la abertura de la pipeta hasta que formen una gigaseal. Luego, al exponer brevemente la punta de la pipeta a la atmósfera, la parte de la membrana que sobresale de la pipeta explota y la membrana está ahora en la conformación de adentro hacia afuera, en la punta de la pipeta. En un sistema completamente automatizado, la pipeta y el parche de membrana se pueden mover rápidamente a través de una serie de diferentes soluciones de prueba, lo que permite aplicar diferentes compuestos de prueba al lado intracelular de la membrana durante el registro.