Perlecan - Perlecan
El perlecano (PLC), también conocido como proteína del núcleo de proteoglicano de heparán sulfato específico de la membrana basal (HSPG) o proteoglicano de heparán sulfato 2 ( HSPG2 ), es una proteína que en los seres humanos está codificada por el gen HSPG2 .
Perlecan se aisló originalmente de una línea de células tumorales y se demostró que está presente en todas las membranas basales nativas. Perlecan es un gran proteoglicano multidominio (cinco dominios, marcado IV) que se une y entrecruza muchos componentes de la matriz extracelular (ECM) y moléculas de la superficie celular . El perlecano es sintetizado por células endoteliales vasculares y del músculo liso y depositado en la matriz extracelular. Perlecan está altamente conservado en todas las especies y los datos disponibles indican que ha evolucionado a partir de ancestros antiguos por duplicación de genes y mezcla de exones .
Estructura
El perlecano consta de una proteína central de peso molecular 470 kDa a la que se unen tres cadenas largas (cada una de aproximadamente 70-100 kDa) de glicosaminoglicanos (a menudo heparán sulfato , HS, pero puede ser condroitín sulfato , CS). La proteína central consta de cinco dominios estructurales distintos . El dominio N-terminal I (aa ~ 1-195) contiene sitios de unión para cadenas HS. Aunque las cadenas HS no son necesarias para el plegamiento y la secreción correctos de la proteína, la falta de HS o la disminución de la sulfatación pueden disminuir la capacidad del perlecano para interactuar con las proteínas de la matriz. La eliminación de las cadenas de HS puede afectar la organización de la matriz y la función de barrera endotelial . El dominio II comprende cuatro repeticiones homólogas a la porción de unión al ligando del receptor de LDL con seis residuos de cisteína conservados y un pentapéptido, DGSDE, que media la unión del ligando por el receptor de LDL. El dominio III tiene homología con el dominio IVa y IVb de laminina . El dominio IV consta de una serie de módulos IG . El dominio V C-terminal, que tiene homología con el dominio G del brazo largo de la laminina, es responsable del autoensamblaje y puede ser importante para la formación de la membrana basal in vivo. El dominio V también tiene sitios de unión para cadenas HS / CS. Por tanto, la proteína del núcleo de perlecano y las cadenas HS podrían modular el ensamblaje de la matriz, la proliferación celular , la unión de lipoproteínas y la adhesión celular .
Función
Perlecan es un componente clave de la matriz extracelular del cartílago donde es esencial para el desarrollo normal de la placa de crecimiento y el crecimiento de huesos largos. El enanismo exhibido por el ratón nulo de perlecano se asemeja al fenotipo producido por la activación de mutaciones en el gen de FGFR3, un receptor de factores de crecimiento de fibroblastos. Perlecan se une a factores de crecimiento involucrados en el desarrollo de la placa de crecimiento. Se ha demostrado que el perlecano aislado de placas de crecimiento en desarrollo se une a FGF-2 a través de sus cadenas laterales de heparán sulfato y a FGF-18 a través del dominio III de su proteína central y media su acción sobre los receptores de FGF. Perlecan probablemente juega un papel crítico en el secuestro y / o liberación de FGF-2 y FGF-18 durante la osificación endocondral.
Perlecan también es un componente clave de la matriz extracelular vascular, donde interactúa con una variedad de otros componentes de la matriz y ayuda a mantener la función de barrera endotelial. El perlecano es un potente inhibidor de la proliferación de las células del músculo liso y, por tanto, se cree que ayuda a mantener la homeostasis vascular. Perlecan también puede promover la actividad del factor de crecimiento (por ejemplo, FGF2 ) y así estimular el crecimiento y la regeneración endotelial.
Modificación de cadenas de glucosaminoglicanos.
Las modificaciones de las cadenas de heparán sulfato en los dominios C- y N-terminales son las diferencias mejor estudiadas en la vía secretora del perlecano. El sulfato de condroitina se puede sustituir por el heparán sulfato y la incorporación de sulfato o la composición de azúcares de las cadenas pueden cambiar. La pérdida de enzimas involucradas en la vía sintética del heparán sulfato conduce a una serie de condiciones.
La modificación diferencial de la cadena de heparán sulfato puede ocurrir a través de una serie de señales reguladoras. El perlecano en la placa de crecimiento de huesos largos de ratón muestra cambios de glicosilación en la progresión de los condrocitos desde la zona de reposo a la zona de proliferación. Aunque inicialmente se pensó que las cadenas de glicosaminoglicano (GAG) del perlecano eran exclusivamente heparán sulfato, las cadenas de condroitín sulfato pueden estar sustituidas y esto puede depender del tipo de célula. Al expresar una forma recombinante del dominio I N-terminal de la proteína y demostrar que la digestión del péptido con heparanasa o condroitinasa no condujo a la pérdida completa de la actividad del péptido, se demostró que las cadenas de condroitín sulfato se pueden agregar a los humanos. perlecan. Esto estaba de acuerdo con datos previos que mostraban cadenas GAG de sulfato de condroitina unidas a perlecano bovino producido por condrocitos y que la proteína del dominio I humano recombinante se glicosilaba con cadenas de sulfato de condroitina y heparán cuando se expresaba en células de ovario de hámster chino. La adición preferencial de cadenas de heparán sulfato o condroitín sulfato a los dominios I y V podría tener un efecto sobre la diferenciación de los tejidos mesenquimales en cartílago, hueso o cualquier número de tejidos, pero el mecanismo regulador del cambio de la adición de heparán sulfato a condroitín sulfato no lo es. bien entendido.
Al estudiar el efecto de la composición de proteoglicanos sobre la permselectividad nefrítica , se observó que el tratamiento con puromicina de células endoteliales glomerulares humanas (HGEC) alteraba el nivel de sulfatación de las cadenas de GAG en proteoglicanos como el perlecano, lo que a su vez causaba una disminución en la estabilidad de GAG. cadenas. Los niveles de ARNm de la proteína central de los proteoglicanos no se vieron afectados, por lo que la disminución de las cadenas de GAG se debió a algún otro factor, que en este caso resultó ser una disminución en la expresión de las enzimas sulfato transferasa , que juegan un papel clave en GAG. biosíntesis. Parece que puede haber cierta superposición en las enfermedades derivadas de la pérdida de la expresión de proteoglicanos de heparán sulfato y la pérdida de enzimas implicadas en la biosíntesis de heparán sulfato.
Degradación
Las células pueden modificar su matriz extracelular y membranas basales en respuesta a señales o estrés. Las proteasas específicas actúan sobre la proteína en el entorno extracelular cuando las células tienen una razón para moverse o cambiar su entorno. La catepsina S es una cisteína proteasa que atenúa moderadamente la unión de células positivas a FGF a un sustrato positivo a perlecano. La catepsina S es una proteasa potencial que actúa sobre la proteína central del perlecano en la membrana basal o estroma.
Las cadenas de heparán sulfato de perlecano se unen a factores de crecimiento en la ECM y sirven como co-ligandos o potenciadores de ligandos cuando se unen a receptores. Otro estudio mostró que la liberación de FGF básico unido a HS en cultivo podría lograrse mediante el tratamiento con estromelisina, heparitinasa I, colagenasa de rata y plasmina, y estos sitios de proteólisis se ilustran en la figura 1. Esto se propuso como una lista no exhaustiva de los proteasas que podrían mediar en la liberación de factores de crecimiento de las cadenas de heparán sulfato de perlecano. Aunque Whitelock et al. sugirieron que existen secuencias consenso de escisión de trombina en la proteína central de perlecan, también postulan que cualquier activación de perlecan por trombina proviene realmente de la escisión de otros constituyentes de ECM. Este artículo establece que la heparanasa es responsable de la escisión de las cadenas de heparán sulfato del perlecano en la matriz. Esto libera factores de crecimiento unidos al heparán sulfato, específicamente FGF-10. La adición de heparanasa al cultivo celular de epitelios en la membrana basal provocó un aumento en la proliferación de células epiteliales debido a la liberación de FGF-10.
En un modelo de crecimiento de explantes in vitro utilizando epitelio corneal, la expresión de metaloproteinasa de matriz (MMP) 2 se correlaciona con una degradación inicial de la membrana basal original. La reforma de la membrana basal en cultivo dependía de una regulación positiva inicial seguida de una regulación negativa de MMP-9, en contraste con la expresión constante de MMP-2. Esto no es evidencia de que MMP-2 y MMP-9 escinden directamente la proteína perlecano in vivo, pero muestra que las proteínas modulan claramente algún factor en la maduración de la membrana basal. Otra familia de metaloproteasas, la proteína morfogenética ósea 1 / familia similar a tolloide, libera el dominio de endorepellina c-terminal de la proteína del núcleo del perlecano. El dominio globular similar a laminina contiene el motivo activo de endorepellina y no puede ser escindido por células que expresan formas mutantes e inactivas de las proteínas BMP-1. Además, el residuo crítico necesario para que tuviera lugar esta escisión se localizó en Asp4197. Este proceso proteolítico puede tener importancia en la enfermedad, ya que se encontró un fragmento correspondiente en la orina de pacientes que padecían insuficiencia renal en etapa terminal y en el líquido amniótico de mujeres embarazadas que habían sufrido una ruptura prematura de la membrana.
Expresión
Expresión durante el desarrollo
El momento de la expresión génica durante el desarrollo varía de un tejido a otro. Las membranas basales son a menudo la fuerza impulsora detrás de la separación del epitelio del estroma y el tejido conectivo. Perlecan es de particular importancia en el desarrollo cardiovascular, neural y cartilaginoso.
El desarrollo de blastocistos antes de la implantación es una cascada controlada de regulación génica y señalización intercelular. El perlecano extracelular se ha observado en la etapa de blastocisto del desarrollo embrionario de ratón, específicamente regulado al alza en el momento en que el embrión alcanza la "capacidad de unión". Este hallazgo se confirmó tanto a nivel de ARNm como a nivel de proteína, mostrado por RT-PCR e inmunotinción. El desarrollo embrionario posterior está regulado con tanta precisión como el desarrollo previo a la implantación, y es más complicado debido a la diferenciación de todos los tejidos. El primer estudio de la expresión del perlecano durante el desarrollo embrionario encontró que la proteína se expresaba primero durante el desarrollo del sistema cardiovascular y luego se correlacionaba con la maduración de la mayoría de los tejidos del cuerpo, es decir, la separación de las capas epiteliales del endotelio y el estroma por las membranas basales. Una vez más, esta regulación positiva durante el desarrollo cardiovascular es concomitante con el papel del extremo C del perlecano como endorepellina.
La especificidad espacio-temporal en la trans-activación del gen perlecan durante el desarrollo es clave para la maduración de las membranas basales y, por lo tanto, para la separación completa del epitelio del endotelio y el estroma. Un estudio exhaustivo de la expresión del perlecano durante el desarrollo del embrión de pollo ha demostrado que el perlecano está presente en la etapa de mórula y durante el resto del desarrollo, aunque la expresión puede ser transitoria y cronometrada con precisión en ciertos tejidos predecesores. En el embrión de rata, se ha demostrado que la expresión de perlecano aumenta en las células del músculo liso vascular (CMLV) después de e19 en el desarrollo fetal. Esto se correlaciona perfectamente con el cese de la proliferación de CMLV en e18 y un cambio en su fenotipo. La teoría presentada en este estudio es que el perlecano desempeña un papel antiproliferativo para las CMLV una vez que se alcanza un cierto punto de desarrollo, al igual que la expresión dependiente de la confluencia del perlecano en la cultura. Estos hallazgos fueron corroborados por resultados similares de estudios de la arteria pulmonar y el epitelio pulmonar de ratas. También se encontró que estos tejidos comenzaban la producción de perlecano una vez que había cesado la división celular, alrededor del día 19 del feto.
El desarrollo del sistema nervioso y la extensión de los axones está dirigido precisamente por señales de las moléculas de la matriz extracelular. El crecimiento de neuritas olfativas en el desarrollo del ratón está guiado, al menos en parte, por un ECM establecido por células epiteliales olfativas (OEC). El perlecano y la laminina-1 parecen ser importantes en esta vía de guía, aunque la inducción de perlecano ocurre un poco más tarde que la de laminina-1. Estos datos están respaldados por datos anteriores que muestran que los OEC expresan FGF-1 durante el desarrollo olfativo y que el perlecano puede estimular el crecimiento de neuritas sensoriales olfativas en cultivo en presencia de FGF-1. Perlecan también mostró propiedades adhesivas a los nervios en un estudio anterior, lo que sugiere además que puede actuar en un papel atractivo en combinación con laminina en lugar de uno repulsivo.
Se ha demostrado que el desarrollo de cartílago y hueso depende de la expresión del perlecano. La proteína se vuelve visible por inmunotinción el día 15 durante el desarrollo del ratón, independientemente de otras proteínas de la membrana basal, lo que sugiere que es simplemente una parte de la ECM de los condrocitos en desarrollo, además del colágeno II y otros marcadores de cartílago que se expresan a partir del día 12. Tomando en cuenta los datos, que los ratones que carecen del gen pln no pueden mantener un cartílago estable, es evidente que el perlecano es esencial para la maduración y estabilidad de la estructura cartilaginosa. Esto está respaldado por un estudio que muestra que la eliminación de la producción de perlecano inhibe las etapas finales de la diferenciación condrogénica en los fibroblastos C3H10T1 / 2 en cultivo. El desarrollo óseo, es decir, la mineralización del tejido cartilaginoso, se correlaciona con la pérdida de perlecano y heparán sulfato en la unión condro-ósea (COJ). En un esfuerzo por comprender cómo el heparán sulfato y el perlecano dirigen las células madre mesenquimales hacia la vía osteogénica, las células madre mesenquimales humanas se trataron con heparanasa y condroitinasa en cultivo. Esto condujo a una mayor mineralización y expresión de marcadores de osteocitos, lo que respalda los datos que muestran que la pérdida de heparán sulfato en el COJ es un factor clave en la osteogénesis. Se cree que la fuerza impulsora detrás de la activación de la osteogénesis por heparanasa y condroitinasa es la liberación de la proteína morfogenética ósea unida a las cadenas de heparán sulfato.
Modelos animales
La caída de Perlecan en el pez cebra embrionario se ha logrado mediante el uso de Morfolinos dirigidos a la transcripción de Perlecan. Se utilizaron morfolinos para bloquear la traducción del ARNm de perlecano en embriones de pez cebra, como parte de una investigación sobre la función del perlecano en el desarrollo esquelético y vascular. El Morfolino se dirige a las cinco regiones principales no traducidas del ARNm de perlecano, bloqueando así la traducción del mensaje. La pérdida de la proteína perlecano en estos peces provocó graves miopatías y problemas de circulación. Como se muestra en un estudio posterior del mismo laboratorio, este fenotipo podría rescatarse mediante la adición de VEGF-A exógeno.
La importancia del perlecano para el desarrollo de los mamíferos se demuestra mediante experimentos de desactivación del gen perlecano. Casi la mitad de todos los ratones en los que se ha eliminado el gen perlecan (ratones nulos de perlecan) mueren en el día embrionario 10,5, cuando el gen perlecan normalmente comienza a expresarse. Otros mueren justo después del nacimiento con defectos graves como la formación anormal de la membrana basal , el desarrollo defectuoso de los huesos cefálicos y largos y la acondroplasia . La estrategia de knockout empleada para uno de los knockouts de perlecan fue una flojación del exón 6 mediante la inserción de un casete de neomicina y la posterior expresión de CRE para la eliminación del exón 6 del genoma. Esto resultó en el fenotipo de cartílago comprometido previamente discutido y la pérdida de la integridad de la membrana basal en una variedad de tejidos. La tasa de mortalidad fetal es alta y los ratones que sobreviven mueren poco después del nacimiento. Se creó un modelo de ratón knockout de perlecan desarrollado por separado mediante la inserción de un casete de neomicina en el exón 7 del gen de perlecan. Estos ratones knockout también fueron un 40% letales para el embrión, y el resto de los ratones murieron poco después del nacimiento debido a anomalías esqueléticas graves. El fenotipo de perlecan knock out en ambos estudios fue idéntico y similar al fenotipo producido por la activación de mutaciones en el gen de FGFR3, un receptor de factores de crecimiento de fibroblastos.
Se usó una construcción de perlecano de longitud completa, bajo el control del promotor de colágeno tipo II, para hacer un ratón transgénico de perlecano. El promotor de colágeno de tipo II permitió la expresión de perlecano en la matriz extracelular formada por condrocitos únicamente, pero no en las membranas basales formadas por células endoteliales, epiteliales o musculares. Este transgén de perlecan en el ratón nulo de perlecan eliminó la letalidad y restauró el crecimiento de huesos largos a la normalidad. Los ratones transgénicos perlecan, sin embargo, exhibieron hipertrofia muscular, lo que indica un papel del perlecan en el desarrollo muscular así como en el crecimiento de huesos largos mediado por la placa de crecimiento del cartílago.
En otro modelo de knockout de ratón, el gen de perlecan fue mutado por recombinación homóloga del gen de perlecan endógeno con una construcción que contiene brazos de 2 y 5 kb de homología que rodean un exón 3 eliminado, que codifica 2 de los 3 sitios de unión de heparán sulfato en el dominio. Yo de perlecan. Sin embargo, el perlecano producido por fibroblastos cultivados de ratones knockout para el exón 3 contenía 40% de sulfato de heparán y 60% de sulfato de condroitina porque, además del sitio de unión de un heparán sulfato que queda en el dominio I, el sitio de unión en el dominio V también estaría presente. . El estudio mostró que los ratones knockout para el exón 3 tenían colapso de la integridad de la cápsula del cristalino en la semana 3 posnatal, lo que indica un papel de los aminoácidos eliminados del dominio I del perlecano en el mantenimiento de la integridad de la membrana basal de la cápsula del cristalino. Sin embargo, a diferencia de los ratones knockout para el perlecano, la viabilidad y el crecimiento de huesos largos en los ratones knockout para el exón 3 fue normal. Esto sugiere que, en la desactivación del exón 3, los sitios de unión restantes para el heparán sulfato en los dominios I y V disponibles para la unión de FGF-2 o el sitio en el dominio 3 disponible para la unión de FGF-18 pueden ser suficientes para el crecimiento normal de huesos largos.
Los cambios en el cristalino en los ratones con inactivación del exón 3 son algo similares al modelo de ratón con inactivación del TGF-β. Los ratones knockout para el exón 3 también mostraron una disminución de la capacidad de cicatrización de heridas y angiogénesis cuando fueron desafiados por una lesión epidérmica o por la adición de FGF-2 a la córnea. En el estudio de la lesión epidérmica, se creó una herida que abarcaba la profundidad de la epidermis en ratones negativos para el exón 3 y ratones de control, y en los ratones knockout, la angiogénesis y las características de la cicatrización de heridas tardaron en desarrollarse posiblemente debido a la disminución del secuestro del factor de crecimiento por el perlecano heparán sulfato negativo. Se produjo un resultado similar en el ensayo de microbolsas corneales, en el que se implanta FGF-2 en la córnea de ratones y en ratones normales se induce la angiogénesis. En los ratones knock-out, este efecto angiogénico se vio afectado, aunque no completamente.
Los estudios de ratones knockout genéticos y enfermedades humanas también han revelado funciones in vivo críticas del perlecano en el desarrollo del cartílago y la actividad de la unión neuromuscular.
Vías de señalización y su efecto en la expresión.
Las vías de señalización funcionan para elevar o disminuir los niveles de transcripción de genes, lo que a su vez hace que las células cambien su perfil de expresión génica. El efecto final de las vías de señalización se ejerce sobre el promotor de genes, que pueden incluir elementos aguas arriba o aguas abajo del sitio de inicio de la transcripción, algunos de los cuales pueden existir dentro del propio gen transcrito. Varias moléculas de señalización pueden efectuar cambios en la expresión de perlecano, incluidas las familias de moléculas del factor de crecimiento transformante Beta (TGF-β), interleucina (IL) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).
Activación transcripcional
Las 2,5 kilobases corriente arriba de la región promotora de perlecano se estudiaron mediante la activación de CAT en líneas celulares de diversos orígenes histológicos. Este estudio concluyó que existía un elemento de respuesta a TGF-β en el promotor solo 285 pares de bases corriente arriba del sitio de inicio de la transcripción. Este resultado se ha corroborado en tejidos como las células de carcinoma de colon humano. y epitelio uterino murino mediante la adición in vitro de la citoquina al medio de cultivo celular. Los estudios in vitro de la señalización de TGF-β1 y sus efectos sobre la expresión del perlecano pueden tener resultados variables en diferentes tipos de células. En cultivo de células de músculo liso coronario humano, la señalización de TGF-β1 no mostró ningún efecto sobre la expresión de perlecano, aunque sí aumentó otros constituyentes de la matriz. La demostración in vivo de la regulación dinámica del perlecano y su control por vías de señalización extracelular es fundamental para nuestra comprensión del papel de la proteína en el desarrollo. Con este fin, se creó una línea de ratón transgénico que expresa TGF-β1 porcino bajo el promotor de cristalina αA específico de la lente y luego se creó otra línea similar pero con el gen impulsado por el promotor de cristalina βb, correspondiente a otro gen específico de la lente. . Este tejido de desarrollo dinámico mostró una mala regulación grave de los componentes de la matriz extracelular, incluido el perlecano con sobreexpresión de TGF-β1. La opacificación de la córnea se produjo en ambas líneas transgénicas al principio del desarrollo debido a una expresión mucho mayor de perlecano, fibronectina y trombospondina-1 en el mesénquima de la córnea. El efecto fue más pronunciado en la línea impulsada por el promotor de βB-1 Crystallin.
La familia IL de citocinas inflamatorias también regula al alza la transcripción de pln. En un modelo de ratón de formación de placa de Alzheimer, la IL-1-alfa produce un aumento en la expresión de perlecano en respuesta a una lesión cerebral. El tratamiento con IL-4 de fibroblastos gingivales humanos en cultivo condujo a un aumento de la producción de varios proteoglicanos de heparán sulfato, incluido el perlecano. El tratamiento de fibroblastos de pulmón humano in vitro con IL-1-beta no condujo a ningún aumento significativo en la producción de perlecano.
Otra vía de señalización que se ha demostrado que aumenta la transcripción de pln es la vía VEGF. El tratamiento con VEGF165 de células endoteliales microvasculares del cerebro humano en cultivo estimula el aumento de la transcripción de pln. Esta molécula es un ligando del Receptor-2 de VEGF (VGFR2), y parece que esta respuesta de VEGF165 es específica para la regulación positiva del perlecano, lo que conduce a un ciclo de retroalimentación positiva que involucra el factor de crecimiento fibroblástico (FGF), el Receptor de FGF (FGFR) y VEGFR2 en respuesta. al daño endotelial. Esta regulación microvascular específica por VEGF165 plantea la posibilidad de que la función anticoagulante del perlecano sea parte del proceso de control de daños en el endotelio cerebral.
La señalización de la proteína quinasa C es supuestamente responsable de regular al alza la transcripción y traducción de ciertos proteoglicanos, incluido el perlecano. Cuando la vía endocítica de las células HeLa se inhibe por la sobreexpresión de una dinamina mutante, la proteína quinasa C se activa y el mensaje de perlecano y la proteína aumentan posteriormente. Por el contrario, la regulación a la baja habitual de perlecan en respuesta a la hiperglucemia se pierde en ratones negativos para PKC-α.
Regulación negativa transcripcional
La señalización del interferón-γ media la represión transcripcional del gen perlecan. Esto se demostró por primera vez en líneas celulares de cáncer de colon y, posteriormente, en líneas celulares de otros orígenes tisulares, pero en cada caso se requirió el factor de transcripción STAT1 intacto para que la señal surtara efecto. Esto llevó a los investigadores a creer que el factor de transcripción STAT1 interactuaba con el promotor Pln en la región distal, localizado en 660 pares de bases corriente arriba del sitio de inicio de la transcripción. El tratamiento con interferón-γ de embriones murinos en etapa de blastocisto conduce a una pérdida de expresión de perlecano en el trofectodermo y, por lo tanto, a una morfología y fenotipo embrionario en el cultivo celular, lo que sugiere que estos blastocistos tratados con interferón-γ serían defectuosos en la implantación. Presumiblemente, la pérdida de expresión de perlecano se debe a la regulación a la baja de la transcripción a través de la actividad del factor de transcripción STAT1, como se mostró anteriormente. Estos resultados in vitro no son necesariamente representativos de las concentraciones fisiológicas normales de interferón-γ, ni la citocina normalmente se expresa ampliamente, sino en momentos de desarrollo muy específicos. Es importante señalar que la expresión de perlecano puede reducirse mediante el tratamiento con una citocina exógena como el interferón-γ, y si hubiera un aumento fisiológicamente anormal en la expresión de la citocina, podría interferir con la implantación.
Estresores celulares y su efecto sobre la expresión.
El estrés mecánico y químico puede dañar las membranas basales o las células que sostienen. Esto podría influir en el perfil de expresión génica de las células, especialmente en su matriz extracelular, que a menudo proporciona soporte físico y una barrera química para las células. Se han examinado la hipoxia, la inflamación, el estrés mecánico y químico en cuanto a cómo se relacionan con la expresión del perlecano.
La hipoxia es una condición que se encuentra en estados patológicos y durante una lesión y, a menudo, da como resultado una falta de proliferación de células endoteliales. Este y el papel del perlecano como endorepellina impulsaron un estudio sobre la naturaleza de la regulación de la expresión del perlecano por las células endoteliales durante condiciones hipóxicas. En condiciones hipóxicas, este estudio encontró que la expresión de perlecano por las células endoteliales microvasculares cardíacas de rata se redujo en un sesenta y uno por ciento en comparación con los controles normales. El argumento de este artículo es que la regulación a la baja del perlecano conduce a una pérdida de activación de FAK y, por lo tanto, a una menor señalización de ERK, lo que conduce a una disminución de la proliferación celular. Parece contradictorio que las células endoteliales proliferen con menos rapidez debido a la pérdida de perlecano y su subunidad endorepellina. Podría ser que estas células endoteliales simplemente regularan negativamente la transcripción de muchos genes en respuesta a condiciones hipóxicas. En otro estudio, la hipoxia condujo a la inducción de genes asociados con la apoptosis y la muerte celular, pero la represión de genes no se limitó a proteínas asociadas con una vía específica. Cuando las células epiteliales intestinales T84 se exponen a condiciones hipóxicas durante 24 horas, se produce un aumento significativo en la producción de ARNm y proteínas de perlecano. Relacionan esto con el hecho de que muchos genes elevados en respuesta a la hipoxia contienen un elemento de respuesta a AMPc (CRE) en su promotor, al igual que pln. Esta diferencia entre las células endoteliales del estudio de 2007 y la célula epitelial estudiada en estos experimentos es indicativa de cuán variados pueden ser los mecanismos reguladores del perlecano en diferentes tipos de células.
El desarrollo de placas de beta-amiloide en el cerebro está asociado con la aparición de la enfermedad de Alzheimer. Estas placas inducen un estado constante de inflamación en áreas de acumulación, lo que lleva a la expresión de ciertos productos génicos relacionados con la inflamación, algunos de los cuales perpetúan la inflamación en el contexto cerebral. Como se mencionó anteriormente, para investigar el efecto de la inflamación cerebral en los niveles de expresión de perlecano, se crearon heridas por punción con agujas en cerebros de ratones y, después de la inflamación y períodos variables de recuperación, se evaluaron los niveles de ARNm y proteínas mediante hibridación in situ e inmunotinción. Los niveles de perlecano aumentaron en el hipocampo pero no en el cuerpo estriado durante el período de curación, junto con la expresión de IL 1-alfa. La expresión de perlecano se rastreó hasta las células microgliales del hipocampo y los astrocitos. Este papel del perlecano en la generación de placa de beta-amiloide está respaldado por un estudio anterior que muestra que el tratamiento con perlecano y beta-amiloide de los cerebros de rata condujo a la formación de placas seniles, mientras que el tratamiento con beta-amiloide solo no tuvo el mismo efecto.
A nivel orgánico, el estrés mecánico tiene un impacto profundo en la integridad de la matriz extracelular y probablemente causa la inducción de varios genes de ECM para la reparación y remodelación de ECM en el estroma tisular y las membranas basales. Un estudio examinó los efectos in vitro de la presión sobre la transcripción genética global utilizando un enfoque de microarrays y un sistema de estiramiento celular destinado a simular la presión intraocular en la lámina cribosa (tejido conectivo) de la cabeza del nervio óptico. Sus hallazgos fueron que el perlecano y varios otros proteoglicanos estaban regulados al alza en respuesta al estímulo de estiramiento. También se indujeron TGF-β2 y VEGF, lo que posiblemente contribuyó a la regulación positiva del transcrito y la proteína de perlecano. Se ha demostrado que la señalización autocrina de TGF-β es un resultado compensatorio del estrés mecánico in vitro en las células endoteliales. Usando un mecanismo de estiramiento celular similar para imitar la presión arterial, esta investigación mostró que la producción de perlecano aumentó en respuesta a la tensión mecánica. Esto depende de la señalización autocrina de TGF-β en un bucle de retroalimentación positiva con p38 y ERK. Este aumento de células endoteliales en la producción de inhibidores del crecimiento de VSMC (es decir, heparina) se invierte en las VSMC, donde el estrés mecánico induce la proliferación. La deformación de las células de CMLV en cultivo conduce a una regulación positiva del perlecano, con un aumento significativo de la sulfatación de las cadenas de heparán sulfato. Esto no contrasta con los datos mostrados en los que la expresión de perlecano es constante más allá de e19 en las CMLV de rata, lo que sugiere que el perlecano desempeña un papel antiproliferativo para las CMLV. En este caso, parece que la función de señalización de la molécula es el factor operatorio regulado al alza, especialmente debido al aumento de la sulfatación de las cadenas de heparán sulfato.
El daño químico a los órganos puede afectar no solo la integridad genética y mecánica de la célula, sino también la matriz extracelular del tejido. Para estudiar el efecto del daño químico en las células hepáticas, se trataron ratas wistar con tetracloruro de carbono durante 48 horas antes del sacrificio. Antes del tratamiento con CCl 4 , la tinción con perlecano se limitaba al conducto biliar y los vasos sanguíneos sinusoidales del hígado. Después del tratamiento, la tinción con perlecano fue intensa en las áreas de necrosis. Esto podría deberse al aumento de la capilarización del hígado como un intento de regenerar el tejido dañado. Un hallazgo similar se mostró en el tratamiento con acetamenofina de ratones, donde el perlecano y otros componentes de la matriz se expresaron en gran medida en las lesiones necróticas del hígado.
Expresión en cultivo celular
Uno de los argumentos contundentes en contra de la validez de los resultados in vitro del cultivo celular en placas de plástico 2D es que el entorno no refleja con precisión el de las células del organismo. Este problema se está resolviendo desarrollando cultivos de células en 3D utilizando una amplia variedad de sustratos como andamios o entornos para las células. En este tipo de situación, la expresión de genes ECM tiene el potencial de parecerse más a la del perfil de expresión nativo. Los armazones 3D, las estructuras sobre las que crecen las células cultivadas, pueden estar compuestos de otras células, es decir, cocultivos, polímeros sintéticos que imitan el entorno natural de las células o ECM purificada como matrigel, y cualquier mezcla de estos tres componentes.
Se ha desarrollado uno de estos sistemas para estudiar el desarrollo de la piel y la formación de la membrana basal entre los queratinocitos y el estroma. Este sistema se utiliza para delinear el desarrollo de la membrana basal entre los fibroblastos en el estroma (en este caso los fibroblastos en un gel de colágeno tipo I) y los queratinocitos que crecen en la parte superior del gel. La expresión de perlecano y, por lo tanto, la maduración de la membrana basal depende de la reticulación del nidogeno del colágeno IV y la cadena de laminina γ1 en este sistema. Este efecto también condujo a una falta de hemidesmosomas en el tejido en desarrollo. Se ha utilizado otro sistema que utiliza un gel de colágeno I hidratado desorganizado para demostrar que los fibroblastos primarios de la córnea humana eventualmente invadirán el gel y crearán una matriz que consta de colágeno tipo I y perlecano, así como varias otras glicoproteínas de matriz sulfatada. Esto imita el programa de desarrollo del fibroblasto corneal in vivo y la respuesta a la lesión.
Uno de los objetivos a largo plazo de la creación de sistemas de cultivo de células en 3D es diseñar tejidos que puedan utilizarse como sustitutos para pacientes con muchos tipos de enfermedades. En válvulas cardíacas de ingeniería tisular creadas mediante la siembra de miofibroblastos en colágeno tipo I seguido de células endoteliales, se ha verificado la expresión de proteoglicanos de heparán sulfato, aunque no se ha hecho ninguna distinción entre sindecano y perlecano en estos tejidos. Otro procedimiento que podría ser posible gracias a la ingeniería de tejidos es la queratoepitelioplastia. El tejido trasplantado debe permanecer intacto, lo que requiere una membrana basal preformada. Los geles de colágeno han promovido la formación de una membrana basal completa por las células epiteliales de la córnea en cultivo.
Perlecan también promete servir como un andamio para sembrar células en cultivo. Las células acinares y ductales de las glándulas salivales humanas se han cultivado con éxito en un péptido bioactivo que contiene una secuencia repetida en el dominio IV de la proteína perlecano. Estas células reproducen estructuras similares a los acinos similares a las que se encuentran en la glándula nativa y las uniones estrechas, junto con membranas basales completas en cultivo.
Asociación de enfermedades
Cáncer
Mientras que la supresión de Perlecan causa una inhibición sustancial del crecimiento tumoral y la neovascularización en ratones nulos, por el contrario, cuando se inyectan células nulas de perlecan en ratones desnudos se observa un crecimiento tumoral mejorado en comparación con los controles. La progresión y patogénesis del cáncer están íntimamente ligadas a la composición de la matriz extracelular y el papel del perlecano y otras moléculas de ECM en el cáncer está siendo estudiado por un gran número de laboratorios. Dado que la membrana basal es el primer obstáculo en la forma de extravasar las células del carcinoma, las funciones del perlecano en este proceso son múltiples. Un sistema modelo utilizado para estudiar la expresión de perlecano en líneas celulares de carcinoma es el de las líneas celulares de progresión metastásica de melanoma MeWo / 70W. Las células MeWo son característicamente menos invasivas que su línea celular variante clonal 70W. Un laboratorio estudió la expresión de perlecan en 27 melanomas invasivos y 26 de las 27 muestras mostraron un aumento significativo en el mensaje de perlecan en comparación con el tejido normal de los mismos pacientes. Luego utilizaron las líneas celulares MeWo y 70W para estudiar si la expresión de perlecan cambiaba durante el tratamiento con neurotrofinas, que pueden estimular la invasión celular a través de matrigel in vitro. Las células 70W más invasivas comenzaron a expresar el mensaje de perlecano diez minutos después de la estimulación con las neurotrofinas, y las células MeWo no produjeron ningún mensaje pln independientemente del tratamiento. Este estudio tomó especial nota del hecho de que la regulación positiva del perlecano ocurrió incluso antes que la de la heparanasa, una proteína esencial involucrada en el proceso de extravasación.
En el cáncer de ovario, como en otros cánceres, la expresión de perlecano se produce de forma diferente a lo largo de la progresión de la enfermedad. La tinción con perlecano se pierde en la membrana basal del ovario que ha sido rota por un adenocarcinoma invasivo, que contrasta con la tinción con perlecano en las membranas basales de los ovarios normales y aquellos con tumores benignos, donde la membrana basal es homogénea y muy similar en composición a la de otros tejidos normales. Esto es consistente con otros resultados que muestran la pérdida de perlecano en las membranas basales afectadas por el cáncer de cuello uterino invasivo que se extiende a los ganglios linfáticos pélvicos, lo que no sorprende debido a la correlación de los niveles elevados de expresión de ARNm de heparanasa con la invasión de un carcinoma de cuello uterino similar. Por el contrario, la formación de tumores de la línea celular epitelial de ratón inmortalizada RT101 inyectada en ratas dependía de la expresión de perlecano por las células de ratón y no de la presencia de perlecano de rata endógeno. Las células RT101 con perlecano anulado por antisentido no mostraron formación de tumores en este sistema, sin embargo, las células que expresan el perlecan antisentido y una construcción recombinante que codifica los dominios I, II y III de perlecan de ratón sí mostraron formación de tumores. Por tanto, en este sistema parece que la expresión de perlecano en las células tumorales es necesaria para la agregación tumoral. Más investigación sobre la cadena de GAG o la modificación de la proteína central por las células tumorales invasoras en comparación con las células tumorales benignas y el tejido normal sería informativa para comprender mejor el papel de los perlecanos en la migración del cáncer.
Varios laboratorios han estudiado la angiogénesis de células tumorales in vitro utilizando construcciones antisentido para el mensaje de perlecano. El ADNc del complemento inverso de longitud completa, impulsado por un promotor fuerte, se transfecta en varios tipos de células para eliminar completamente la expresión de perlecano. El antisentido en las células de carcinoma de colon bloquea la traducción del perlecano, lo que conduce a una disminución del crecimiento tumoral y de la angiogénesis. Se produjo una disminución similar de la proliferación in vitro en las células NIH 3T3 y en una línea celular de melanoma humano que expresaba ARNm de perlecano antisentido. Los hallazgos in vitro con las líneas celulares de sarcoma de Kaposi mostraron que la pérdida de perlecano a través de la transfección con una construcción antisentido condujo a una disminución de la proliferación y migración de este tipo de células altamente metastásicas. Estos resultados contrastan con los resultados in vivo con las mismas líneas de sarcoma de Kaposi, que muestran que la disminución del perlecano conduce a un aumento de la angiogénesis, lo que facilita la migración y, por lo tanto, se asocia con un aumento del grado tumoral. La eliminación antisentido de perlecan en líneas celulares de fibrosarcoma condujo a un mayor crecimiento y migración tanto in vitro como in vivo. Estos hallazgos de una mayor tumorigénesis in vivo están respaldados por datos que muestran que el extremo C de la proteína perlecano actúa como un módulo endostático ahora conocido como endorepellina.
Se creó una construcción de ribozima para su uso en la reducción de los niveles de traducción de perlecano. Esta ribozima se dirigió a una secuencia que codifica el dominio I de la proteína perlecano. Redujo la expresión de perlecano hasta en un 80% en la línea celular de cáncer de próstata C42B. En contraste con los estudios discutidos anteriormente, estas células produjeron tumores más pequeños que sus células parentales cuando se inyectaron en ratones atímicos. Se desconoce qué significa esta disparidad en los resultados para la invasión, aunque es cierto que el perlecano es parte de la matriz extracelular en el tejido mesenquimatoso, y las células que experimentan la transición epitelio-mesenquimatosa (EMT) pueden regular al alza la expresión de perlecan como parte de su programación EMT.
Diabetes y enfermedad cardiovascular
Los niveles de perlecano están disminuidos en muchas enfermedades, por ejemplo, diabetes , aterosclerosis y artritis . Perlecan tiene un papel importante en el mantenimiento de la barrera de filtración glomerular. La disminución del perlecano en la membrana basal glomerular tiene un papel central en el desarrollo de albuminuria diabética . La expresión de perlecan está regulada negativamente por muchos estímulos aterogénicos y, por lo tanto, se cree que Perlecan desempeña un papel protector en la aterosclerosis. La diabetes y la aterosclerosis son síndromes comúnmente asociados. El 80% de las muertes asociadas a la diabetes involucran alguna forma de complicación aterosclerótica y la membrana basal del endotelio se ha implicado en el proceso aterogénico. Se demostró que la síntesis de heparán sulfato disminuye en las arterias de los diabéticos y en las arterias que desarrollan lesiones ateroscleróticas.
El mecanismo por el cual el heparán sulfato se regulaba negativamente en estas lesiones permaneció desconocido durante algún tiempo. Una teoría establece que la glucosa alta en circulación podría conducir a una disminución en la unión de la cadena GAG al perlecano, pero no necesariamente a un cambio en la ruta sintética de las cadenas GAG o la de la proteína central. Después del tratamiento de células endoteliales aórticas humanas con medio con alto contenido de glucosa, el perlecano secretado contenía menos incorporación de sulfato acompañada de una menor incorporación total de la cadena GAG. Aunque no se identifica una vía de señalización que conduzca a esta disminución en la incorporación de la cadena GAG, se sugiere que la pérdida del 30% en la glicosilación general de la proteína podría significar la pérdida de una de las tres cadenas HS en el perlecano en este modelo de hiperglucemia asociada a la diabetes. También se observa que se producen disminuciones similares en HS extracelular sin un cambio en la tinción de las cadenas proteicas centrales en riñones diabéticos y en células renales en cultivo tratado con glucosa alta.
La aterosclerosis suele ser la culpable de la enfermedad coronaria y otras afecciones cardiovasculares, y una gran agregación de proteína perlecano es sintomática de placas ateroscleróticas avanzadas. Los CMLV son los productores del perlecano en esta condición, lo que significa que una gran cantidad de investigación se ha centrado en comprender los medios de regulación al alza del perlecano en esta condición. En una prueba del efecto de los ácidos grasos no esterificados circulantes (sintomáticos de diabetes y aterogénesis) sobre la expresión de perlecano por las CMLV, la expresión no cambió en comparación con las células de control. Esto contrastaba con un aumento de 2-10 veces en la expresión de otros proteoglicanos de la membrana basal. La trombina es otro marcador asociado con la aterogénesis y la procoagulación, y regula al alza de forma selectiva la producción de perlecano pero no de otros proteoglicanos en las CMLV humanas en cultivo. Se sugiere que este efecto solo se ve cuando las CMLV alcanzan la confluencia, pero no antes de la confluencia. Este concepto es similar a los estudios mencionados anteriormente que muestran que el perlecán solo es producido por las CMLV una vez que han cesado la proliferación durante el desarrollo. Otro marcador en la vía aterosclerótica es la angiotensina II, que también regula al alza la expresión de perlecano en las CMLV en cultivo. Dada la importancia de la expresión del perlecano en la aterosclerosis, existe la posibilidad de una terapia basada en la expresión del perlecano y la investigación puede eventualmente avanzar en esa dirección.
Enfermedad genética
Las mutaciones en el gen HSPG2 , que codifica el perlecano, causan displasia dissegmentaria, tipo Silverman-Handmaker y síndrome de Schwartz-Jampel .
Interacciones
Se ha demostrado que Perlecan interactúa con
- FBLN2 ,
- FGF7 ,
- FGFBP1 y
- Transtiretina .
- FGF-2,
- FGF-18
Referencias
enlaces externos
- perlecan en los encabezamientos de materias médicas (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU .