Resonancia magnética nuclear espectroscópica - Nuclear magnetic resonance spectroscopy

Un instrumento de RMN de 900 MHz con un imán de 21,1  T en HWB-NMR , Birmingham, Reino Unido

La espectroscopia de resonancia magnética nuclear , más comúnmente conocida como espectroscopia de RMN o espectroscopia de resonancia magnética ( MRS ), es una técnica espectroscópica para observar campos magnéticos locales alrededor de núcleos atómicos . La muestra se coloca en un campo magnético y la señal de RMN se produce mediante la excitación de la muestra del núcleo con ondas de radio en resonancia magnética nuclear , que se detecta con receptores de radio sensibles. El campo magnético intramolecular alrededor de un átomo en una molécula cambia la frecuencia de resonancia, dando así acceso a los detalles de la estructura electrónica de una molécula y sus grupos funcionales individuales. Como los campos son únicos o muy característicos de los compuestos individuales, en la práctica de la química orgánica moderna , la espectroscopia de RMN es el método definitivo para identificar compuestos orgánicos monomoleculares .

El principio de la RMN generalmente implica tres pasos secuenciales:

  1. La alineación (polarización) de los espines nucleares magnéticos en un campo magnético constante aplicado B 0 .
  2. La perturbación de este alineamiento de los espines nucleares por un magnético oscilante débil campo , normalmente se conoce como radio- frecuencia del pulso (RF).
  3. Detección y análisis de las ondas electromagnéticas emitidas por los núcleos de la muestra como consecuencia de esta perturbación.

Del mismo modo, los bioquímicos utilizan la RMN para identificar proteínas y otras moléculas complejas. Además de la identificación, la espectroscopia de RMN proporciona información detallada sobre la estructura, la dinámica, el estado de reacción y el entorno químico de las moléculas. Los tipos más comunes de RMN son la espectroscopia de RMN de protón y carbono 13 , pero es aplicable a cualquier tipo de muestra que contenga núcleos que posean espín .

Los espectros de RMN son únicos, bien resueltos, analíticamente manejables y, a menudo, altamente predecibles para moléculas pequeñas . Los diferentes grupos funcionales son obviamente distinguibles, y los grupos funcionales idénticos con sustituyentes vecinos diferentes todavía dan señales distinguibles. La RMN ha reemplazado en gran medida las pruebas de química húmeda tradicionales , como los reactivos de color o la cromatografía típica para la identificación. Una desventaja es que se requiere una cantidad relativamente grande, de 2 a 50 mg, de una sustancia purificada, aunque puede recuperarse mediante un tratamiento. Preferiblemente, la muestra debe disolverse en un solvente, porque el análisis de RMN de sólidos requiere una máquina de hilar de ángulo mágico dedicada y puede no dar espectros igualmente bien resueltos. La escala de tiempo de la RMN es relativamente larga y, por lo tanto, no es adecuada para observar fenómenos rápidos, produciendo solo un espectro promediado. Aunque se muestran grandes cantidades de impurezas en un espectro de RMN, existen mejores métodos para detectar impurezas, ya que la RMN no es inherentemente muy sensible, aunque a frecuencias más altas, la sensibilidad es mayor.

La espectroscopia de correlación es un desarrollo de la RMN ordinaria. En la RMN bidimensional , la emisión se centra alrededor de una sola frecuencia y se observan resonancias correlacionadas. Esto permite identificar los sustituyentes vecinos del grupo funcional observado, lo que permite una identificación inequívoca de las resonancias. También existen métodos 3D y 4D más complejos y una variedad de métodos diseñados para suprimir o amplificar tipos particulares de resonancias. En la espectroscopia nuclear de efecto Overhauser (NOE), se observa la relajación de las resonancias. Como la NOE depende de la proximidad de los núcleos, la cuantificación de la NOE para cada núcleo permite la construcción de un modelo tridimensional de la molécula.

Corte de un imán de RMN que muestra su estructura: escudo de radiación, cámara de vacío, recipiente de nitrógeno líquido, recipiente de helio líquido y calzas criogénicas .

Los espectrómetros de RMN son relativamente caros; las universidades suelen tenerlos, pero son menos habituales en las empresas privadas. Entre 2000 y 2015, un espectrómetro de RMN costó entre 500.000 y 5 millones de dólares . Espectrómetros de RMN modernos tienen una muy fuerte, grande y costoso helio líquido -cooled superconductores imán, ya que la resolución depende directamente de la intensidad del campo magnético. También se encuentran disponibles máquinas menos costosas que utilizan imanes permanentes y una resolución más baja, que aún brindan un rendimiento suficiente para ciertas aplicaciones, como el monitoreo de reacciones y la verificación rápida de muestras. Incluso hay espectrómetros de resonancia magnética nuclear de sobremesa . La RMN se puede observar en campos magnéticos de menos de una militesla. La RMN de baja resolución produce picos más amplios que pueden superponerse fácilmente entre sí, lo que provoca problemas en la resolución de estructuras complejas. El uso de campos magnéticos de mayor fuerza da como resultado una resolución clara de los picos y es el estándar en la industria.

Historia

El crédito por el descubrimiento de la RMN es para Isidor Isaac Rabi , quien recibió el Premio Nobel de Física en 1944. El grupo Purcell de la Universidad de Harvard y el grupo Bloch de la Universidad de Stanford desarrollaron de forma independiente la espectroscopia de RMN a finales de la década de 1940 y principios de la de 1950. Edward Mills Purcell y Felix Bloch compartieron el Premio Nobel de Física de 1952 por sus descubrimientos.

Técnicas básicas de RMN

La muestra de RMN se prepara en un tubo de vidrio de pared delgada, un tubo de RMN .

Frecuencia de resonancia

Cuando se colocan en un campo magnético, los núcleos activos de RMN (como 1 H o 13 C) absorben radiación electromagnética a una frecuencia característica del isótopo . La frecuencia de resonancia, la energía de la radiación absorbida y la intensidad de la señal son proporcionales a la fuerza del campo magnético. Por ejemplo, en un campo magnético de 21 Tesla , los núcleos de hidrógeno (comúnmente conocidos como protones) resuenan a 900 MHz. Es común referirse a un imán de 21 T como un imán de 900 MHz ya que el hidrógeno es el núcleo más comúnmente detectado; sin embargo, diferentes núcleos resonarán a diferentes frecuencias en esta intensidad de campo en proporción a sus momentos magnéticos nucleares .

Manipulación de muestras

Un espectrómetro de RMN generalmente consiste en un portamuestras giratorio dentro de un imán muy fuerte, un emisor de radiofrecuencia y un receptor con una sonda (un conjunto de antena) que va dentro del imán para rodear la muestra, opcionalmente bobinas de gradiente para mediciones de difusión. y electrónica para controlar el sistema. Por lo general, es necesario girar la muestra para promediar el movimiento de difusión; sin embargo, algunos experimentos requieren una muestra estacionaria cuando el movimiento de la solución es una variable importante. Por ejemplo, las mediciones de las constantes de difusión ( espectroscopia ordenada por difusión o DOSY) se realizan utilizando una muestra estacionaria con centrifugación, y las celdas de flujo se pueden utilizar para el análisis en línea de los flujos del proceso.

Disolventes deuterados

La gran mayoría de moléculas en una solución son moléculas de solvente, y la mayoría de los solventes regulares son hidrocarburos y, por lo tanto, contienen protones activos por RMN. Para evitar detectar solo señales de átomos de hidrógeno de disolvente, se utilizan disolventes deuterados en los que más del 99% de los protones se reemplazan con deuterio (hidrógeno-2). El disolvente deuterado más utilizado es el deuterocloroformo (CDCl 3 ), aunque se pueden utilizar otros disolventes por diversas razones, como la solubilidad de una muestra, el deseo de controlar los enlaces de hidrógeno o los puntos de fusión o ebullición. Los cambios químicos de una molécula cambiarán ligeramente entre disolventes, y el disolvente utilizado casi siempre se informará con cambios químicos. Los espectros de RMN a menudo se calibran contra el pico de protón residual de disolvente conocido en lugar de tetrametilsilano añadido.

Calzar y bloquear

Para detectar los cambios de frecuencia muy pequeños debido a la resonancia magnética nuclear, el campo magnético aplicado debe ser constante en todo el volumen de la muestra. Los espectrómetros de RMN de alta resolución utilizan calzas para ajustar la homogeneidad del campo magnético a partes por mil millones ( ppb ) en un volumen de unos pocos centímetros cúbicos. Para detectar y compensar la falta de homogeneidad y la deriva en el campo magnético, el espectrómetro mantiene un "bloqueo" en la frecuencia del deuterio del disolvente con una unidad de bloqueo separada, que es esencialmente un transmisor y un procesador de RF adicionales sintonizados con el núcleo de bloqueo (deuterio) en lugar de los núcleos de la muestra de interés. En los espectrómetros de RMN modernos, la compensación se ajusta automáticamente, aunque en algunos casos el operador tiene que optimizar los parámetros de la compensación manualmente para obtener la mejor resolución posible.

Adquisición de espectros

Tras la excitación de la muestra con un pulso de radiofrecuencia (60-1000 MHz), se obtiene una respuesta de resonancia magnética nuclear, una desintegración por inducción libre (FID). Es una señal muy débil y requiere receptores de radio sensibles para captar. Se lleva a cabo una transformada de Fourier para extraer el espectro en el dominio de la frecuencia del FID en el dominio del tiempo sin procesar. Un espectro de un solo FID tiene una relación señal / ruido baja , pero mejora fácilmente con el promedio de adquisiciones repetidas. Se pueden adquirir buenos espectros de 1 H RMN con 16 repeticiones, lo que lleva solo unos minutos. Sin embargo, para elementos más pesados ​​que el hidrógeno, el tiempo de relajación es bastante largo, por ejemplo, alrededor de 8 segundos para 13 C. Por tanto, la adquisición de espectros cuantitativos de elementos pesados ​​puede llevar mucho tiempo, de decenas de minutos a horas.

Después del pulso, los núcleos se excitan, en promedio, hasta un cierto ángulo frente al campo magnético del espectrómetro. El grado de excitación se puede controlar con el ancho del pulso, típicamente ca. 3-8 µs para el pulso óptimo de 90 °. El ancho del pulso se puede determinar trazando la intensidad (con signo) en función del ancho del pulso. Sigue una curva sinusoidal y, en consecuencia, cambia de signo en anchos de pulso correspondientes a pulsos de 180 ° y 360 °.

Los tiempos de decaimiento de la excitación, normalmente medidos en segundos, dependen de la efectividad de la relajación, que es más rápida para núcleos más ligeros y en sólidos, y más lenta para núcleos más pesados ​​y en soluciones, y pueden ser muy largos en gases. Si el segundo pulso de excitación se envía prematuramente antes de que se complete la relajación, el vector de magnetización promedio no ha decaído al estado fundamental, lo que afecta la fuerza de la señal de una manera impredecible. En la práctica, las áreas de los picos no son proporcionales a la estequiometría; sólo es posible discernir la presencia, pero no la cantidad de grupos funcionales. Se puede realizar un experimento de recuperación de inversión para determinar el tiempo de relajación y, por lo tanto, el retraso requerido entre pulsos. Se transmite un pulso de 180 °, un retardo ajustable y un pulso de 90 °. Cuando el pulso de 90 ° cancela exactamente la señal, el retardo corresponde al tiempo necesario para 90 ° de relajación. La recuperación de la inversión es útil para 13 C cuantitativo , 2D y otros experimentos que requieren mucho tiempo.

Cambio químico

Una carga giratoria genera un campo magnético que da como resultado un momento magnético proporcional al giro. En presencia de un campo magnético externo, existen dos estados de espín (para un espín 1/2 núcleo): un espín hacia arriba y otro hacia abajo, donde uno se alinea con el campo magnético y el otro se opone a él. La diferencia de energía (ΔE) entre los dos estados de giro aumenta a medida que aumenta la fuerza del campo, pero esta diferencia suele ser muy pequeña, lo que lleva al requisito de imanes de RMN potentes (1-20 T para los instrumentos de RMN modernos). La irradiación de la muestra con energía correspondiente a la separación exacta del estado de giro de un conjunto específico de núcleos provocará la excitación de ese conjunto de núcleos en el estado de menor energía al estado de mayor energía.

Para espín 1/2 núcleos, la diferencia de energía entre los dos estados de espín a una intensidad de campo magnético dada es proporcional a su momento magnético. Sin embargo, incluso si todos los protones tienen los mismos momentos magnéticos, no dan señales resonantes con los mismos valores de frecuencia. Esta diferencia surge de los distintos entornos electrónicos del núcleo de interés. Tras la aplicación de un campo magnético externo, estos electrones se mueven en respuesta al campo y generan campos magnéticos locales que se oponen al campo aplicado mucho más fuerte. Por tanto, este campo local "protege" al protón del campo magnético aplicado, que por lo tanto debe aumentarse para lograr la resonancia (absorción de energía de rf). Estos incrementos son muy pequeños, generalmente en partes por millón (ppm). Por ejemplo, el pico de protón de un aldehído se desplaza ca. 10 ppm en comparación con un pico de hidrocarburo, ya que como grupo captador de electrones , el carbonilo desprotege el protón al reducir la densidad electrónica local. Por tanto, la diferencia entre 2,3487 T y 2,3488 T es de unas 42 ppm. Sin embargo, una escala de frecuencia se usa comúnmente para designar las señales de RMN, aunque el espectrómetro puede operar barriendo el campo magnético y, por lo tanto, 42 ppm son 4200 Hz para una frecuencia de referencia (rf) de 100 MHz.

Sin embargo, dado que la ubicación de diferentes señales de RMN depende de la intensidad del campo magnético externo y de la frecuencia de referencia, las señales generalmente se informan en relación con una señal de referencia, generalmente la de TMS ( tetrametilsilano ). Además, dado que la distribución de las señales de RMN depende del campo, estas frecuencias se dividen por la frecuencia del espectrómetro. Sin embargo, dado que estamos dividiendo Hz por MHz, el número resultante sería demasiado pequeño y, por lo tanto, se multiplica por un millón. Por lo tanto, esta operación da un número de localizador llamado "desplazamiento químico" con unidades de partes por millón. En general, los cambios químicos para los protones son altamente predecibles, ya que los cambios están determinados principalmente por efectos de blindaje más simples (densidad electrónica), pero los cambios químicos para muchos núcleos más pesados ​​están más fuertemente influenciados por otros factores, incluidos los estados excitados (contribución "paramagnética" al blindaje tensor).

Ejemplo de desplazamiento químico: espectro de RMN del hexaborano B 6 H 10 que muestra picos desplazados en frecuencia, lo que da pistas sobre la estructura molecular. (haga clic para leer los detalles de la interpretación)

El cambio químico proporciona información sobre la estructura de la molécula. La conversión de los datos brutos a esta información se denomina asignación del espectro. Por ejemplo, para el espectro de 1 H-NMR para etanol (CH 3 CH 2 OH), uno esperaría señales en cada uno de tres cambios químicos específicos: uno para el grupo C H 3 , uno para el grupo C H 2 y uno para el grupo O H. Un grupo típico de CH 3 tiene un desplazamiento de alrededor de 1 ppm, un CH 2 unido a un OH tiene un desplazamiento de alrededor de 4 ppm y un OH tiene un desplazamiento de entre 2 y 6 ppm según el disolvente utilizado y la cantidad de enlaces de hidrógeno . Mientras que el átomo de O extrae la densidad de electrones del H adjunto a través de su enlace sigma mutuo, los pares de electrones solitarios en el O bañan al H en su efecto de blindaje.

En la espectroscopia de RMN paramagnética , las mediciones se realizan en muestras paramagnéticas. El paramagnetismo da lugar a desplazamientos químicos muy diversos. En la espectroscopia de 1 H RMN, el rango de desplazamiento químico puede extenderse hasta miles de ppm.

Debido al movimiento molecular a temperatura ambiente, los tres protones de metilo promedian durante el experimento de RMN (que normalmente requiere unos pocos ms ). Estos protones se degeneran y forman un pico en el mismo cambio químico.

La forma y el área de los picos también son indicadores de la estructura química. En el ejemplo anterior, el espectro de protones del etanol, el pico de CH 3 tiene tres veces el área del pico de OH. De manera similar, el pico de CH 2 sería el doble del área del pico de OH pero solo 2/3 del área del pico de CH 3 .

El software permite analizar la intensidad de la señal de los picos, que en condiciones de relajación óptima, se correlacionan con el número de protones de ese tipo. El análisis de la intensidad de la señal se realiza mediante integración , el proceso matemático que calcula el área bajo una curva. El analista debe integrar el pico y no medir su altura porque los picos también tienen ancho, y por lo tanto su tamaño depende de su área, no de su altura. Sin embargo, debe mencionarse que el número de protones, o cualquier otro núcleo observado, es solo proporcional a la intensidad, o la integral, de la señal de RMN en los experimentos de RMN unidimensionales más simples. En experimentos más elaborados, por ejemplo, experimentos que se usan típicamente para obtener espectros de RMN de carbono 13 , la integral de las señales depende de la tasa de relajación del núcleo y sus constantes de acoplamiento escalar y dipolar. Muy a menudo, estos factores se conocen poco; por lo tanto, la integral de la señal de RMN es muy difícil de interpretar en experimentos de RMN más complicados.

Acoplamiento en J

Multiplicidad Razón de intensidad
Camiseta (s) 1
Doblete (d) 1: 1
Triplete (t) 1: 2: 1
Cuarteto (q) 1: 3: 3: 1
Quinteto 1: 4: 6: 4: 1
Sexteto 1: 5: 10: 10: 5: 1
Septeto 1: 6: 15: 20: 15: 6: 1
Ejemplo 1 Espectro de RMN H (unidimensional) de etanol representado como intensidad de señal frente a desplazamiento químico . Hay tres tipos diferentes de átomos de H en el etanol con respecto a la RMN. El hidrógeno (H) en el grupo −OH no se acopla con los otros átomos de H y aparece como un singlete, pero los hidrógenos CH 3 - y −CH 2 - se acoplan entre sí, dando como resultado un triplete y un cuarteto respectivamente.

Parte de la información más útil para la determinación de la estructura en un espectro de RMN unidimensional proviene del acoplamiento J o acoplamiento escalar (un caso especial de acoplamiento espín-espín ) entre núcleos activos de RMN. Este acoplamiento surge de la interacción de diferentes estados de espín a través de los enlaces químicos de una molécula y da como resultado la división de las señales de RMN. Para un protón, el campo magnético local es ligeramente diferente dependiendo de si un núcleo adyacente apunta hacia o en contra del campo magnético del espectrómetro, lo que da lugar a dos señales por protón en lugar de una. Estos patrones de división pueden ser complejos o simples y, del mismo modo, pueden ser directamente interpretables o engañosos. Este acoplamiento proporciona información detallada sobre la conectividad de los átomos en una molécula.

El acoplamiento a n núcleos equivalentes (espín ½) divide la señal en un multiplete n +1 con relaciones de intensidad siguiendo el triángulo de Pascal como se describe a la derecha. El acoplamiento a espines adicionales conducirá a más divisiones de cada componente del multiplete, por ejemplo, el acoplamiento a dos núcleos ½ de espín diferentes con constantes de acoplamiento significativamente diferentes dará lugar a un doblete de dobletes (abreviatura: dd). Tenga en cuenta que el acoplamiento entre núcleos que son químicamente equivalentes (es decir, que tienen el mismo desplazamiento químico) no tiene ningún efecto en los espectros de RMN y los acoplamientos entre núcleos que están distantes (generalmente más de 3 enlaces separados para protones en moléculas flexibles) suelen ser demasiado pequeños para causar divisiones observables. Los acoplamientos de largo alcance sobre más de tres enlaces a menudo se pueden observar en compuestos cíclicos y aromáticos , lo que conduce a patrones de división más complejos.

Por ejemplo, en el espectro de protones para el etanol descrito anteriormente, el grupo CH 3 se divide en un triplete con una relación de intensidad de 1: 2: 1 por los dos protones CH 2 vecinos . De manera similar, el CH 2 se divide en un cuarteto con una relación de intensidad de 1: 3: 3: 1 por los tres protones CH 3 vecinos . En principio, los dos protones de CH 2 también se dividirían nuevamente en un doblete para formar un doblete de cuartetos por el protón hidroxilo, pero el intercambio intermolecular del protón hidroxilo ácido a menudo da como resultado una pérdida de información de acoplamiento.

El acoplamiento a cualquier núcleo de espín-1/2, como el fósforo-31 o el flúor-19, funciona de esta manera (aunque las magnitudes de las constantes de acoplamiento pueden ser muy diferentes). Pero los patrones de división difieren de los descritos anteriormente para núcleos con espín mayor que ½ porque el número cuántico de espín tiene más de dos valores posibles. Por ejemplo, el acoplamiento al deuterio (un núcleo de espín 1) divide la señal en un triplete 1: 1: 1 porque el espín 1 tiene tres estados de espín. De manera similar, un núcleo de espín 3/2 como el 35 Cl divide una señal en un cuarteto 1: 1: 1: 1 y así sucesivamente.

El acoplamiento combinado con el desplazamiento químico (y la integración de los protones) nos informa no solo sobre el entorno químico de los núcleos, sino también sobre el número de núcleos activos NMR vecinos dentro de la molécula. En espectros más complejos con múltiples picos en cambios químicos similares o en espectros de núcleos distintos del hidrógeno, el acoplamiento es a menudo la única forma de distinguir núcleos diferentes.

1 H RMN espectro de mentol con desplazamiento químico en ppm en el eje horizontal. Cada protón magnéticamente desigual tiene un cambio característico, y los acoplamientos con otros protones aparecen como la división de los picos en multipletes: por ejemplo, el pico a , debido a los tres protones magnéticamente equivalentes en el grupo metilo a , se acoplan a un protón adyacente ( e ) y así aparece como un doblete.

Acoplamiento de segundo orden (o fuerte)

La descripción anterior supone que la constante de acoplamiento es pequeña en comparación con la diferencia en las frecuencias de RMN entre los espines no equivalentes. Si la separación del cambio disminuye (o la fuerza del acoplamiento aumenta), los patrones de intensidad del multiplete primero se distorsionan y luego se vuelven más complejos y menos fáciles de analizar (especialmente si están involucrados más de dos giros). La intensificación de algunos picos en un multiplete se consigue a expensas del resto, que en ocasiones casi desaparece en el ruido de fondo, aunque la zona integrada debajo de los picos permanece constante. En la mayoría de las RMN de campo alto, sin embargo, las distorsiones suelen ser modestas y las distorsiones características ( techado ) pueden ayudar a identificar picos relacionados.

Algunos de estos patrones pueden analizarse con el método publicado por John Pople , aunque tiene un alcance limitado.

Los efectos de segundo orden disminuyen a medida que aumenta la diferencia de frecuencia entre multipletes, de modo que los espectros de RMN de campo alto (es decir, de alta frecuencia) muestran menos distorsión que los espectros de frecuencia más baja. Los primeros espectros a 60 MHz eran más propensos a la distorsión que los espectros de máquinas posteriores que normalmente operaban a frecuencias de 200 MHz o superiores.

Además, como en la figura de la derecha, el acoplamiento en J se puede utilizar para identificar la sustitución orto-meta-para de un anillo. El acoplamiento orto es el más fuerte a 15 Hz, Meta sigue con un promedio de 2 Hz y, finalmente, el para acoplamiento suele ser insignificante para los estudios.

Desigualdad magnética

Pueden ocurrir efectos más sutiles si espines químicamente equivalentes (es decir, núcleos relacionados por simetría y por lo tanto que tienen la misma frecuencia de RMN) tienen diferentes relaciones de acoplamiento con espines externos. Los giros que son químicamente equivalentes pero no indistinguibles (según sus relaciones de acoplamiento) se denominan magnéticamente no equivalentes. Por ejemplo, los 4 sitios H del 1,2-diclorobenceno se dividen en dos pares químicamente equivalentes por simetría, pero un miembro individual de uno de los pares tiene diferentes acoplamientos con los espines que forman el otro par. La desigualdad magnética puede conducir a espectros muy complejos que solo pueden analizarse mediante modelos computacionales. Tales efectos son más comunes en los espectros de RMN de sistemas aromáticos y otros sistemas no flexibles, mientras que el promedio conformacional sobre enlaces C-C en moléculas flexibles tiende a igualar los acoplamientos entre protones en carbonos adyacentes, reduciendo los problemas de desigualdad magnética.

Espectroscopia de correlación

La espectroscopia de correlación es uno de varios tipos de espectroscopia bidimensional de resonancia magnética nuclear (RMN) o 2D-RMN . Este tipo de experimento de RMN es mejor conocido por su acrónimo , COSY . Otros tipos de RMN bidimensional incluyen espectroscopía J, espectroscopía de intercambio (EXSY), espectroscopía de efecto de Overhauser nuclear (NOESY), espectroscopía de correlación total (TOCSY) y experimentos de correlación heteronuclear, como HSQC , HMQC y HMBC . En la espectroscopia de correlación, la emisión se centra en el pico de un núcleo individual; si su campo magnético está correlacionado con otro núcleo por enlace pasante (COSY, HSQC, etc.) o acoplamiento a través del espacio (NOE), también se puede detectar una respuesta en la frecuencia del núcleo correlacionado. Los espectros de RMN bidimensionales proporcionan más información sobre una molécula que los espectros de RMN unidimensionales y son especialmente útiles para determinar la estructura de una molécula , particularmente para moléculas que son demasiado complicadas para trabajar utilizando RMN unidimensional. El primer experimento bidimensional, COSY, fue propuesto por Jean Jeener, profesor de la Université Libre de Bruxelles, en 1971. Este experimento fue implementado más tarde por Walter P. Aue, Enrico Bartholdi y Richard R. Ernst , quienes publicaron su trabajo en 1976.

Resonancia magnética nuclear de estado sólido

Espectrómetro de RMN de estado sólido de 900 MHz (21,1 T) en la instalación nacional canadiense de RMN de campo ultra alto para sólidos

Diversas circunstancias físicas no permiten estudiar las moléculas en solución y, al mismo tiempo, tampoco mediante otras técnicas espectroscópicas a nivel atómico. En medios en fase sólida, tales como cristales, polvos microcristalinos, geles, soluciones anisotrópicas, etc., es en particular el acoplamiento dipolar y la anisotropía de desplazamiento químico los que se vuelven dominantes en el comportamiento de los sistemas de espín nuclear. En la espectroscopia de RMN en estado de solución convencional, estas interacciones adicionales conducirían a una ampliación significativa de las líneas espectrales. Una variedad de técnicas permite establecer condiciones de alta resolución que pueden, al menos para espectros de 13 C, ser comparables a los espectros de RMN en estado de solución.

Dos conceptos importantes para la espectroscopia de RMN de estado sólido de alta resolución son la limitación de la posible orientación molecular por la orientación de la muestra y la reducción de las interacciones magnéticas nucleares anisotrópicas por el giro de la muestra. De este último enfoque, el giro rápido alrededor del ángulo mágico es un método muy destacado, cuando el sistema comprende 1/2 núcleos de giro. Velocidades de giro de ca. Se utilizan 20 kHz, lo que exige equipos especiales. En la actualidad, en la espectroscopia de RMN se utilizan varias técnicas intermedias, con muestras de alineación parcial o movilidad reducida.

Las aplicaciones en las que se producen efectos de RMN de estado sólido suelen estar relacionadas con investigaciones de estructura en proteínas de membrana, fibrillas de proteínas o todo tipo de polímeros y análisis químico en química inorgánica, pero también incluyen aplicaciones "exóticas" como hojas de plantas y pilas de combustible. Por ejemplo, Rahmani et al. estudiaron el efecto de la presión y la temperatura en el autoensamblaje de las estructuras bicelares mediante espectroscopia de RMN de deuterio.

Espectroscopia de RMN biomolecular

Proteínas

Gran parte de la innovación dentro de la espectroscopia de RMN se ha realizado en el campo de la espectroscopia de RMN de proteínas , una técnica importante en biología estructural . Un objetivo común de estas investigaciones es obtener alta resolución estructuras 3-dimensionales de la proteína, similar a lo que puede lograrse por cristalografía de rayos X . A diferencia de la cristalografía de rayos X, la espectroscopia de RMN suele limitarse a proteínas de menos de 35 kDa , aunque se han resuelto estructuras más grandes. La espectroscopia de RMN es a menudo la única forma de obtener información de alta resolución sobre proteínas no estructuradas total o parcialmente intrínsecamente . Ahora es una herramienta común para la determinación de relaciones de actividad de conformación donde la estructura antes y después de la interacción con, por ejemplo, un candidato a fármaco se compara con su actividad bioquímica conocida. Las proteínas son órdenes de magnitud más grandes que las pequeñas moléculas orgánicas discutidas anteriormente en este artículo, pero también se aplican las técnicas básicas de RMN y alguna teoría de RMN. Debido al número mucho mayor de átomos presentes en una molécula de proteína en comparación con un pequeño compuesto orgánico, los espectros 1D básicos se llenan de señales superpuestas hasta el punto en que el análisis espectral directo se vuelve insostenible. Por tanto, se han ideado experimentos multidimensionales (2, 3 o 4D) para abordar este problema. Para facilitar estos experimentos, es deseable etiquetar isotópicamente la proteína con 13 C y 15 N porque el isótopo 12 C predominante de origen natural no es activo en RMN y el momento del cuadrupolo nuclear del isótopo 14 N predominante de origen natural evita que se transmita información de alta resolución. que se obtiene a partir de este isótopo de nitrógeno. El método más importante utilizado para la determinación de la estructura de proteínas utiliza experimentos NOE para medir distancias entre átomos dentro de la molécula. Posteriormente, las distancias obtenidas se utilizan para generar una estructura 3D de la molécula resolviendo un problema de geometría de distancias . La RMN también se puede utilizar para obtener información sobre la dinámica y la flexibilidad conformacional de diferentes regiones de una proteína.

Ácidos nucleicos

La RMN de ácido nucleico es el uso de la espectroscopia de RMN para obtener información sobre la estructura y dinámica de los ácidos polinucleicos , como el ADN o el ARN . En 2003, casi la mitad de todas las estructuras de ARN conocidas se habían determinado mediante espectroscopía de RMN.

La espectroscopia de RMN de ácidos nucleicos y proteínas son similares, pero existen diferencias. Los ácidos nucleicos tienen un porcentaje más pequeño de átomos de hidrógeno, que son los átomos que normalmente se observan en la espectroscopia de RMN, y debido a que las hélices dobles de los ácidos nucleicos son rígidas y aproximadamente lineales, no se pliegan sobre sí mismas para dar correlaciones de "largo alcance". Los tipos de RMN hace generalmente con los ácidos nucleicos son 1 H o RMN de protón , 13 C RMN , 15 N de RMN , y 31 P RMN . Casi siempre se utilizan métodos de RMN bidimensionales , como la espectroscopia de correlación (COSY) y la espectroscopia de transferencia de coherencia total (TOCSY) para detectar acoplamientos nucleares de enlace directo, y la espectroscopia de efecto Overhauser nuclear (NOESY) para detectar acoplamientos entre núcleos cercanos a unos a otros en el espacio.

Los parámetros tomados del espectro, principalmente los picos cruzados NOESY y las constantes de acoplamiento , se pueden usar para determinar características estructurales locales como ángulos de enlace glicosídico, ángulos diedros (usando la ecuación de Karplus ) y conformaciones de fruncido de azúcar. Para estructuras a gran escala, estos parámetros locales deben complementarse con otros supuestos o modelos estructurales, porque los errores se suman a medida que se atraviesa la doble hélice y, a diferencia de las proteínas, la doble hélice no tiene un interior compacto y no se pliega hacia atrás. sí mismo. La RMN también es útil para investigar geometrías no estándar, como hélices dobladas , emparejamiento de bases que no son de Watson-Crick y apilamiento coaxial . Ha sido especialmente útil en el sondeo de la estructura de oligonucleótidos de ARN naturales, que tienden a adoptar conformaciones complejas, tales como tallo de bucles y pseudoknots . La RMN también es útil para sondear la unión de moléculas de ácido nucleico a otras moléculas, tales como proteínas o fármacos, al ver qué resonancias se desplazan tras la unión de la otra molécula.

Carbohidratos

La espectroscopia de RMN de carbohidratos aborda cuestiones sobre la estructura y conformación de los carbohidratos . El análisis de carbohidratos por 1H NMR es un desafío debido a la variación limitada en los grupos funcionales, lo que conduce a resonancias de 1H concentradas en bandas estrechas del espectro de NMR. En otras palabras, hay poca dispersión espectral. Las resonancias de protones anoméricos se segregan de las demás debido al hecho de que los carbonos anoméricos llevan dos átomos de oxígeno. Para carbohidratos más pequeños, la dispersión de las resonancias de protones anoméricos facilita el uso de experimentos 1D TOCSY para investigar los sistemas de espín completos de residuos de carbohidratos individuales.

Descubrimiento de medicamento

El conocimiento de los mínimos de energía y las barreras de energía rotacional de moléculas pequeñas en solución se puede encontrar usando RMN, por ejemplo, mirando las preferencias conformacionales del ligando libre y la dinámica conformacional, respectivamente. Esto se puede utilizar para orientar las hipótesis de diseño de fármacos, ya que los valores experimentales y calculados son comparables. Por ejemplo, AstraZeneca utiliza RMN para su investigación y desarrollo en oncología.

Ver también

Métodos relacionados de espectroscopia nuclear :

Referencias

Otras lecturas

enlaces externos

  • James Keeler. "Comprensión de la espectroscopia de RMN" (reimpreso en la Universidad de Cambridge ) . Universidad de California, Irvine . Consultado el 11 de mayo de 2007 .
  • Los conceptos básicos de la RMN : una descripción general no técnica de la teoría, el equipo y las técnicas de la RMN por el Dr. Joseph Hornak, profesor de química en RIT
  • Bibliotecas GAMMA y PyGAMMA : GAMMA es una biblioteca C ++ de código abierto escrita para la simulación de experimentos de espectroscopia de resonancia magnética nuclear. PyGAMMA es una envoltura de Python alrededor de GAMMA.
  • relax Software para el análisis de la dinámica de RMN
  • Vespa - VeSPA (Versatile Simulation, Pulses and Analysis) es un paquete de software gratuito compuesto por tres aplicaciones Python. Estas herramientas basadas en GUI son para simulación espectral de resonancia magnética (MR), diseño de pulsos de RF y procesamiento y análisis espectral de datos de MR.